基因操作原喜理03.ppt

自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆 菌染色体而不显张力或不稳定。 拷贝数低: 1 有助于减少DNA 分子间重组 保证文库转化子生长平衡 减小对受体菌的毒副作用 实例 嗜碱菌“12-1” （Bacillus sp.） 文库法克隆嗜碱性相关的基因或基因簇 1.外源片段的制备PFGE pulse field gel electrophoresis 2.载体的制备 3. 连接 载体与外源之比约 10：1 避免嵌合克隆的形成 常规连接：外源：载体=3：1 4.转化（电转化electroporation） 感受态细胞的制备：离子 转化：12.5kv/cm 25uF 200Ω 转化子的挑取：LB+Cm x-gal+IPTG PNASMichelle R. Rondon Department of Plant Pathology, University of Wisconsin-Madison We constructed a BAC library in Escherichia coli from genomic DNA of the Gram-positive bacterium Bacillus cereus. This library provides 5.75-fold coverage of the B. cereus genome, with an average insert size of 98?kb. To determine the extent of heterologous expression of B. cereus genes in the library, we screened it for expression of several B. cereus activities in the E. coli host. 7.阳性克隆子筛选 PAC PAC系由pAd10sacBⅡ 衍化而来，除去了腺病毒的填充片段，插入了基于pUC质粒的序列。 提高载体的产量，电穿孔转化代替体外包装。 三、噬菌粒 phagemid 带有丝状噬菌体复制起点的质粒 DNA合成的起始，终止，形态发生 含phagemid的细菌被M13(或 f1)感染后，基因II蛋白作用于间隔区，启动滚环复制→ssDNA→包装 pUC118/119 pBluescript pGEM-3Zf(±) pTZ18U/R 19U/R Help phage dsDNA 稳定，高产,具有质粒的特征 免却亚克隆至M13 得到10kb ssDNA 缺点： ssDNA产量低, 重复性差 M13mp→1012 pfu 5～10?g/ml phagemid 1/100～1/10 影响产量的因素 携带的IG的确切序列（干扰helper复制） 在plasmid 中的位置（干扰helper复制） helper phage的性质 外源DNA大小 pUC118/119 M13KO7 1-5 x 1011 pfu 四、M13KO7 （8.7kb） M13的衍生株 突变的geneII (间隔区的插入对复制影响不大) 质粒复制起点（p15A） Kanr(Tn903) IG突变 M13KO7 感染E.coli 质粒复制,产生phage 蛋白 突变的geneII蛋白可作用于M13KO7的突变IG 产生ssDNA,产生phage M13KO7 感染E.coli(pUC118) 质粒复制,产生phage 蛋白 突变的geneII蛋白优先作用于pUC118的IG 产生pUC118的ssDNA,产生phage(pUC118) M13KO7→E.coli(pUC118)→ssDNA变成RF DNA→按质粒方式复制并产生所有蛋白（phagemid不干扰M13KO7的早期复制）→geneII产物优先结合于phagemid上的复制起点→优先合成phagemid (+)ssDNA (强50倍) 第五节 人工染色体载体 一、酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome 酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 ?3?m 代时90min 16条