基因工程-wj20理131208.ppt

转基因生物的意义是什么？ 转基因生物有广泛的应用价值： 生长发育、疾病发生和治疗的研究手段： 疾病的转基因动物模型 改良动植物性状： 产量、抗病性、耐寒性等 用于生产基因工程产品： 生产抗体、疫苗、细胞因子等 转基因动物的基本流程 构建携带目的基因的载体 外源基因导入：目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中 使目的基因整合到基因组中 将受精卵或胚胎植入体动物 使其发育成转基因动物 转基因动物的关键步骤有哪些？ 上游—如何改造基因？如何构建载体？ 中游—如何进行基因转移？如何进行胚胎移植？ 下游—如何进行基因的检测与细胞的筛选？ 上游—基因改造和载体构建 外源基因: 完整的转录单位，应顺式作用元件、结构基因和转录终止信号等 报告基因 (report gene) : 在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因 GFP、 LacZ、AP、LUC 常用哪些载体？ 腺病毒载体 逆转录病毒载体 非重组病毒载体：质粒等 中游—基因转移和胚胎移植 基因导入技术：物理、化学和生物学方法 显微注射法 (microinjection)：转基因的常规方法 胚胎干细胞法(embryonic stem cells，ESC)：更多用于基因剔除 逆转录病毒感染法 精子载体法 DNA显微注射法 制备超量受精卵 DNA 显微注射 转移卵到输卵管或子宫 鉴定转基因鼠 鼠系建立 DNA 显微注射法有什么特点？ 未发生核融合的受精卵精原核比卵原核大，DNA 一般注射到的精原核 线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数倍，通常注射去除载体序列的线状 DNA 整合是随机的，有干扰正常基因功能的可能性 效率较低，实际成功率可能只有 1/1000 显微注射法的流程示意图 胚胎干细胞法 胚胎干细胞(embryo stem cells，ESC)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞 重新导入另一胚胎后，仍然保持分化能力 胚胎干细胞法的流程 分离培养 ESC 外源基因导入 ESC ESC 的子宫转移 转基因鼠的鉴定 鼠系建立 胚胎干细胞法的流程示意图 胚胎干细胞法有什么特点？ 定点整合：载体携带定点整合元件，避免随机整合 定点整合事实上就是 knockin 外源基因导入后可用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞，相对较简单 所获得的小鼠为嵌合体 需筛选生殖细胞获得外源基因的小鼠 下游—基因检测与筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测 鉴定方法： PCR、Southern blot、染色体原位杂交 RT-PCR、Northern blot、Western blot 基因转移鼠纯合鼠系的建立 × 转基因杂合鼠 未转基因鼠 生殖系细胞中不含转入基因 生殖系细胞中含转入基因 多次交配可得到纯合鼠系 转基因动物有什么用途？ 改良动物品系 制备基因产品：乳腺、膀胱生物反应器 分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能 人类疾病的转基因动物模型 模拟人类疾病的发生和发展，帮助了解病因 为测试治疗方案提供一个统一有效的系统 动物的克隆 1996 年，首次实现动物的无性生殖 核移植技术(Nuclear Transfer) 由绵羊体细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质 二、基因打靶 基因打靶(Gene Targeting) ：通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能 基因敲除(gene knockout): 将某个基因定向去除 基因敲入(gene knockin): 定向将一段基因序列替代另一段基因序列 基因打靶就是一种特殊的动物转基因方法 如何进行基因打靶？ 构建打靶载体的 将打靶载体导入 ESC 筛选与鉴定基因敲除的 ESC 将 ESC 注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫 筛选杂合体鼠系 杂交建立基因打靶的纯合鼠系 如何构建和筛选打靶载体？ 正-负筛选(Positive-negative-selection)： Neor 抗药性基因和 HSV-tk 自杀基因 如何获得基因敲除小鼠？ 基因敲除 ESC 注射入胚泡，植入假孕小鼠的子宫 子代小鼠杂交 　　嵌合体 　　 　　杂合体 　　 　　纯合体 也可利用 RNA 干扰进行基因敲除 基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除 适合于在动物整体水平上进行 RNA 干扰不是敲除基因，而是诱导 mRNA 的特异性降解，干扰基因的表达 一般适合在细胞水平上进行 RNA 干扰 1990 年，Jorgense 等通过转基因改造牵牛花颜色 外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成内源基因表达的降低 补