第八章号电泳技术复件.ppt

电泳技术刘松财2011 二、电泳分类 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。区带电泳的分类如下：  带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒大小和形状有关。一般说来，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈慢。泳动速度除了受颗粒本身性质的影响外，还和其它外界因素有关，它们之间的相互关系可用下式表示： 在正常情况下进行电泳时，胶体粘度，介电常数及电势梯度都在同一条件下，故胶体分子大小及其所带电荷多少，决定其泳动速度。由于样品中各种蛋白质的分子量不同，等电点不同，所带电荷多少亦不相同，在一定条件下各种蛋白质的泳动速度(迁移率)各异。 影响迁移率的因素有如下几个方面： 1.样品 带电颗粒本身的性质在几个方面影响着它的迁移率 (1)电荷：迁移率随着带电颗粒净电荷的增加而增加，电荷量的大小一般由pH决定。 (2)大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电引力的增加，迁移率下降。 (3)形状 同样大小，但具有不同形状的分子，如纤维状蛋白质和球状蛋白质，因摩擦力和静电引力的不同，而表现出不同的迁移率。 2.电场 根据实验的需要，电泳可分为两种，一种是常压电泳，电压在500伏特以下，分离时间较长。另一种是高压电泳，电压为1000伏特以上，电泳时间很短，有时仅需数分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等生物大分子物质；高压电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。 欧姆定律表示了电流(A)、电压(V)和电阻(Ω)之间的关系：A＝v/Ω (1)电流 迁移率与电流成正比。带电颗粒迁移的距离与通电时间也成正比。电泳时必须保持电流的恒定。 (2)电压 电压控制着电流，因此迁移率与加在支持介质两端的电位差(端电压)成正比。 (3)电阻 迁移率与电阻成反比 3.缓冲液 (1)成分 (2)pH 溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。 (3)离子强度 一般最适的离子强度在0.02～0.2之间 4.电渗 电泳时，滤纸、醋酸纤维素薄膜等支持物在缓冲液中都带有负电荷，而与这些支持物接触的水溶液则带正电荷(静电吸引)。电泳时，由于滤纸、醋纤膜等固定不动，于是带正电荷的水就流向负极，并携带颗粒也—起向负极移动。由于电渗现象与电泳作用同时存在，当电泳方向与电渗方向—致时，其蛋白迁移的距离等于两者相加之和；若两者方向相反时，则颗粒的泳动距离为电泳的距离减去电渗的距离。 凝胶电泳的支持介质： 固体支持介质可以分两类：一类是纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、纤维素等。这些介质相对来说是化学惰性的，能将对流减到最小。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙酰胺凝胶。这些凝胶介质不仅能防止对流，扩散最小，而且它们是多孔介质，孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，因而具有分子筛的作用。因而在进行分离时不仅取决于分子的电荷密度，还取决于分子的大小。 聚丙烯酰胺是通过丙烯酰胺和N、N′-亚甲双丙烯酰胶在适当的游离基催化加速制作用下聚合而成的。催化加速剂一般是0.1－0.3％(W/V)的过硫酸铵与0.1－0.3％(W/V)的β-二甲氨基丙腈(DMAP)或N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)。凝胶的孔径由丙烯酰胺单体和交联剂N，N’-亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。 一般来说，不同分子量的蛋白质，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所选择的凝胶浓度不同，详见下表。 电泳的操作过程 (1)支持介质的饱和 (2)加样 (3)样品的分离 (4)取出支持介质 (5)染色和物质的回收 几种染科 1．氨基黑10B 氨基黑10B　C22H13O12N6S3Na3，MW=715，λmax=620nm-630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐,氨基黑染不同蛋白质的着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等) 2．考马斯亮蓝R250　 C45H44O8H3S2Na，MW=824，λmax=560nm-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。 3．考马斯克蓝G250　　比考马斯亮蓝R250多二个甲基。 MW＝854，λmax=5,90nm-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色 4．银染色　　银染的机制是将蛋白带上的硝酸银离子还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。银染的灵敏度高，可以检测低于1 ng的蛋白质。 四、电泳技术的应用 生物分子纯度鉴定 蛋白质分子量的测定 蛋白质等电点的检测 蛋白质的鉴定