一株鼠抗人4-1bbl功能性单克隆抗体的研制及生是物学特性的研究.docx

一栋鼠抗入套lBBL功缝性单克整撬体的研制及生物学特性鳇研究 一栋鼠抗入套lBBL功缝性单克整撬体的研制及生物学特性鳇研究 孛文藏要 一株鼠抗人4—1BBL功能性单克隆抗体的研制及生物学特 性的研究 中文摘要 4．1BBL(CDl 37L)是II型跨膜糖蛋白分予，TNF超家族成员，表达于各种活化的 抗原提里细胞(舢℃)表面，如IFN-y活化的巨噬细胞、CD40配体活化的B细胞、 单核细胞、树突状细胞(De)、T细胞、肿瘤细胞等。编码入4．1BBL的基因位于19p13．3。 其受体4．1BB(CDl37)为秘疆受体(霹话R)超家族成员，分子量为30薹=④的王型 跨膜糖蛋自，表达予活纯的C》n和CD8+譬细胞表面。4．1BB愆．1BBL介导的协同 刺激信号可以诱导T细胞的活化，增殖及抗凋亡作用，同时还可维持T细胞的长期 生存及提高细胞因子的分泌。4—1BB，4．1BBL可以协同CD28／B7促进T细胞IL．2的 分泌，4．1BBL亦可独立于CD28传递协同刺激信号联合TCR信号参与T细胞的活 化，并在初次免疫应答的后期，二次免疫应答及免疫记忆中发挥效应。4．1BBL还可 介导逆尚信号诱导单核细胞、瓣瘤细胞的增殖及促进其细胞因子的分泌。这种逆向信 号可能在肿瘤免疫应答中起至关重要的作用。4IlBBL分子的激动剂或拮抗剂的研制 及其在4．1BB|／4．1BBL信号传导调节作用的研究在肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性 疾病中具有重要的理论研究意义和应用价值。 1．本研究以4．1BBL转基因细胞株L929／4．1BBL为免疫原，免疫BALB／c小鼠， 采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／o进行 细胞融合，以【舵9阵lBBL细胞株作为阳性细胞株，以转基因细胞的母本细胞L929 作为阴性对照细胞株，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内细胞的反复筛选并经 多次的亮隆化培养，最终获得l株持续、稳定分泌鼠抗人4．1懿BL单克隆抗体的杂交 癯细胞株，命名为3E7。经体外长期传代培养和液氮冻存后复苏，杂交瘤细胞生长良 好，分泌抗体的性能稳定。该抗体效价在l：l000以上，纯化后抗体蛋白用予间接免 疫荧光分析的用量为O．25~2．0鹏／l×106细胞。经快速定性试纸法鉴定单抗3E7的重 链为IgGl。单抗3E7与商品化单抗C65485识别4一lBBL分子的抗原位点不同。 一株鬣撬入拳18转毛臻麓性萃尧隆撬体熬研制发生物学特性的硗究 一株鬣撬入拳18转毛臻麓性萃尧隆撬体熬研制发生物学特性的硗究 中文攘簧 2．为了研究单克隆抗体对4．1BBL分子表达细胞的识别和结合，选择表达4。lBBL 膜分子的人单核性自血病细胞株U937以及SHI．1、人早幼粒白血病细胞株l{L．60、 人红白血病细胞株K562、恶性B淋巴瘤细胞株Daudi和骨髓瘤细胞株8226，通过问 接免疫荧光标记法及流式细胞仪分析，结果显示，单抗3E7能特异性的地识别上述血 液系统恶性肿瘤细胞株上表达的4．1BBL分子。 3．经过细脆计数、光镜观察及流式细胞仪分析证实单抗3E7能介导逆向信号诱导 人单核细胞在体外有效扩增(3～4倍)，进一步用ELIsA检测细胞培养上清，结果显 示，单抗3E7能有效地促进单核细胞分泌IL．6和1NF．a。 4．流式细胞仪检测结果显示，H】r，60细胞和Ur937细胞表匾表达4．IBBL膜蛋白； 与流式结果相应，RT-PCR检测到HL．60细胞和U937细胞有4．1BBL删陋A胞外段 转录本，可见H060细胞和U937细胞膜表面组成性表达4．1BBL分子。细胞计数结 果显示，牟lBBL单抗3E7能显著促进H060细臆和U937细胞的体外生长，提示H060 细脆和Ur937细胞上的4．1BBL分子同样能够介导逆向信号，并且通过逆翔信号促进 这两种白血瘸细胞株的生长，促进其分泌IL．6，使之进入S期的细胞比例增加。 5．用4．1BBL单抗3E7和TLR4商品抗体标记HL-60细胞，发现HL一60细胞组成 性共表达4．1BBL分子和TUH分子，激光共聚焦显微镜观测到HL．60细胞上存在 4．1BBL与TLR_4的共定位现象。迸一步实验发现，4．1BBL与TLR-4在37℃条件下 出现了共内吞，嘲此表明4．1BBL确实在功麓上与礼酣有一定的关系。 综上所述，本研究成功的地获得了l株稳定和特异分泌抗入冬王BBL的功能性单 壳隆摭体的杂交癯(3E7)，证实所分泌的抗人4．18BL单克隆抗体通过逆向信号显著 地诱导人外周血单核细胞的体外生长。单抗3E7可促进白血病肿瘤细胞株HL-60和 U937体外生