一种鸭肉磷脂酶的分没离纯化和酶学性质分析.docx

张露娟：鸭肉磷脂水解酶的分离纯化及其酶学性质研究 张露娟：鸭肉磷脂水解酶的分离纯化及其酶学性质研究 三 摘要 f螋必荆 南京板鸭是中国传统的腌腊肉制品之一，具有悠久的历史和独特的风味。众多学者的 研究都证实腌腊肉制品特有的风味与脂类物质尤其是磷脂的降解有关，而磷脂的变化与磷 脂水解酶系的作用密不可分。曾有学者从宏观角度在腌腊肉制品加工过程中跟踪过磷脂水 解酶系的活力变化，这就更进一步肯定了磷脂水解酶系在腌腊肉制品风味形成中的地位， 因此研究磷脂水解酶系在肉制品加工过程中的活性变化与作用机制，对于深入了解腌腊肉 制品生产过程中脂类物质的变化机理，揭示脂类物质变化与风味形成之间的关系具有重要 的意义。目前只有少部分研究者检测过南京板鸭生产过程中总磷脂酶的活力，但从原材料 中将磷脂水解酶系提取出来并深入到分子水平去研究腌腊肉制品中磷脂水解酶系的作用 机制的相关资料却极少。 本课题首次通过结合Sourcel 5Q离子交换层析法和Superdex200凝胶层析法从新鲜鸭 肉中分离纯化得到一种具有磷脂酶A2活性的磷脂水解酶，并初步研究了这种酶的部分酶学 性质，为南京板鸭风味形成的机理研究、加工过程的调控以及传统工艺的改进提供理论依 据。具体研究内容和结果如下： (1)鸭肉磷脂粗酶液的提取及酶活分析。以鸭股二头肌为原料，优化了鸭肉肌内磷脂 水解酶的提取过程并检测了各种鸭肉肌内磷脂水解酶的酶活(酸性脂肪酶、中性脂肪酶、 总磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D)。结果显示，鸭股二头肌磷脂酶A2活性远高 于胸脯肉；股二头肌中磷脂酶A2的活性远高于其他磷脂水解酶的活性；肌内磷脂水解酶提 取缓冲液0．1mol·L‘1嘶s．HCl的最佳pH为8．0，最佳盐析条件为70％饱和度的硫酸铵溶液。 (2)分离纯化鸭肉磷脂酶A2。以上述获得的粗酶液为原料，本实验首先尝试使用 Sourcel5Q(1．5x5．5cm)离子交换层析进行纯化，并对离子交换层析的条件进行优化，最终确 定为pH8．0，50mmol·L。1Tris．HCl为A相，含1mol·LdNaCl的pH8．0，50retool·L‘1Tris．HCl 为B相，平衡流速为1．0ml·min1，洗脱流速为1．5ml·min～，35min达到100％B，上样量为 500p1。然后将得到的活性峰再次上样于Superdex200(1．0x30cm)凝胶层析，最终经 SDS．PAGE证实，获得了一种电泳的具有磷脂酶A2活性的磷脂水解酶，并通过薄层析法和 液相色谱法证实了这种酶的活性。 (3)部分酶学性质的初步研究。SDS．PAGE电泳测得该具有磷脂酶A2活性的磷脂水解 酶的表观分子量约为82．3KDa：通过研究该种酶的基本酶学性质发现，NaF对其活性酶液 没有抑制作用，所以这肯定不是脂肪酶，这种磷脂酶A2的最适反应温度为25℃，最适反 应pH为7．5，Ca2+对该酶的活性基本没有影响，纯化的酶液经超滤浓缩后在4C下可以保 扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 2 存最佳时间约为3d，若要长期保存，则需要将浓缩后的酶液冷冻干燥后再保存。 关键词：鸭肉磷脂水解酶系提取纯化酶学性质 张露娟：鸭肉磷脂水解酶的分离纯化及其酶学性质研究 张露娟：鸭肉磷脂水解酶的分离纯化及其酶学性质研究 3 Ab stract Nanjing cured—dry duck is one of the China traditional cured—dry products，which has long history and special flavor．Many researchers have proved that the special flavor is related witIl the degradation of lipids especially phospholipid．and the change of phospholipid is related witll phospholipid hydrolysis enzyme．Some scholars have follow the track of the activity’S change of phospholipid hydrolysis enzyme from macro perspective during the processing of cured-dry meat products，which confirmed the function of phospholipid hydrolysis enzyme in the flavor’S form of cured-dry meat products furthen Studyhag th