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第五章目的基因的克隆来与基因文库的构建.ppt

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第五章目的基因的克隆来与基因文库的构建

生物工程专业核心课程 基因工程的基本概念 A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去,每接一个单体就是一个循环反应,包括:基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲,DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法;具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐,基本上已淘汰;后者反应中间物的分离程序简便,DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT: 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 基因等 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序 基因文库的基本概念 基因库与基因文库 基因库(gene pool) 特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library or gene bank) 从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式 基因组文库(含有全部基因) 存在(人工构建)。根据构建方法的不同,基因文库分为: cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因) 基因文库的基本概念 基因文库构建的基本战略 用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA 在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然, cDNA文库的信息量远小于基因组文库 基因文库的基本概念 基因文库的完备性 基因文库的完备性是指:在构建的基因文库中任一基因存在的概 率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示: N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中: P = 任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如,人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp,基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb,则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆;而当完备性提高到0.9999时,基因文库至少需要180 万个克隆 基因文库的基本概念 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件: 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 基因文库的构建程序 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性, 用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大,经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低,重组率和完备性也就越高 A A A A 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 胶中,然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中

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