第六章 基因操作中大分子分离和分析.pdfVIP

6章 基因操作中大分子的分 离和分析 n DNA的分离、检测和纯化 n RNA的分离、检测和纯化 n 分子杂交 n RNA作图和端点分析 n 重组DNA分子导入大肠杆菌 6.1 DNA的分离、检测和纯化 n DNA是基因的物质载体，是基因操作的重点对象。 n 在实际操作中主要涉及两类DNA，其一 目的物种 或细胞的基因组DNA，其二是克隆载体和装载在载 体中的克隆化基因。 n 载体和基因绝大多数是以质粒的形式保存在大肠 杆菌中，这就决定了许多基因操作是从大肠杆菌 开始的。 1 6.2 RNA的分离、检测和纯化 n 在细胞中除了DNA外还有RNA，即rRNA、tRNA和 mRNA。对于基因操作来说，涉及到的RNA主要 mRNA，而mRNA在细胞中的含量又 最少的。 ⒈溶液和用具的去RNA酶的处理 n 高温干热灭菌 n 0.1%焦碳酸二乙酯 （DEPC）处理过的水浸泡后再 灭菌，对可能接 RNA的溶液，要求用DEPC处理的 水配制。 n 对于电泳用具在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再 用3% H O 和0.1%DEPC处理的水浸泡，清洗干净。 2 2 ⒉RNA酶抑制剂的使用 6.3 分子杂交 n 根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、 Northern杂交和Western杂交，以及由此而简化的 斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。 n 在3个主要的分子杂交过程中，都 先将DNA或RNA 或蛋白质样品在凝胶上进行分离，使不同相对分 子量的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品 通过影印的方式转移到固相支持物也就 滤膜上。 2 6.3.1 Southern杂交 ⒈Southern印迹转移 图6-3 Southern印迹转移装置图 ⒉分子杂交 n DNA分子的滤膜 预杂交 标记的核酸探 针与滤膜杂交 洗涤将游离的探针分子除去 通过放射自显影或生化检测 3 6.3.2 Northern杂交 n 总体过程与Southern杂交相似，只不过在 Blotting过程中转移的 RNA而不 DNA。 n Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中 否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录 水平上某基因 否表达，在有合适对照的情况 下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。 6.3.3 Western杂交 n 将蛋白质样品从SDS凝胶通过电转移方式转 移到滤膜的方法，称为Western印迹转移。 n 杂交过程 通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上 否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其相对分 子量。 n 主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某 抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基 因是否表达。 4 6.3.4 其他分子杂交 ⒈菌落杂交 n 先将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上，然后再 生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放 出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或 哪些菌落含有与探针同源的DNA。 ⒉ 菌斑杂交 n 与菌落杂交相似，所检测 噬菌体。通过将噬菌体基因文库 中的噬菌斑影印到滤膜上使噬菌体中的DNA释放并固定在滤膜 上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些噬菌斑含有与探针同 源的DNA。