第六章 克隆基因表达.pptVIP

一、外源基因表达机制 P169 （一）外源基因的起始转录 启动子和相关调控序列的作用 增强子 衰减子等 （四）表达蛋白在细胞中的稳定性 构建融合蛋白表达系统、构建分泌蛋白表达系统、构建包涵体表达系统、选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统. （五）目的基因沉默（gene silencing） 导入并整合到受体细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因个体中表达活性受到抑制的现象。 位置效应基因沉默：甲基化、异染色质区等 转录水平的基因沉默：启动子甲基化、基因异染色质化 转录后水平的基因沉默（PTGS） 二、外源基因表达系统 P161 原核基因表达系统：大肠杆菌基因表达系统 芽孢杆菌基因表达系统 真核基因表达系统：酵母基因表达系统 昆虫基因表达系统 植物细胞基因表达系统 动物细胞基因表达系统 原核基因表达系统（大肠杆菌中表达系统） （一）原核生物基因表达的特点 P153 （二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征P161 1、大肠杆菌表达外源基因的优势 （1）遗传背景清楚。 全基因组测序，基因组结构简单，便于基因操作和分析。 （2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应表达载体， 目标基因表达水平高。 （3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 （三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 1、启动子 常用启动子： 乳糖启动子Plac的可控性：乳糖启动子均为抗葡萄 糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物阻遏， 转录呈基底状态。 2、终止子（terminator) P163 3、核糖体结合位点（RBS） 大肠杆菌中，翻译起始时，首先是核糖体小亚基（30S）识别和结合到mRNA5’端的翻译起始部位，该顺序称为核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS） SD序列：位于翻译起始密码子上游的5-13个核 苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’。 起始密码子及其5端若干密码子的影响： 90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。 AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。 4. 生物体对密码子的偏爱性： 简并密码子使用频率在不同生物或同一生物不 同蛋白质翻译时不同，具有偏爱性。 pCP3:温度可诱导型的复制子 28℃：每个细胞拷贝数为60 42℃：拷贝数增至300-600个 （四）大肠杆菌基因工程菌的构建策略 包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 1、包涵体异源蛋白的表达 P175 外源基因在大肠杆菌高水平表达，表达量占细胞总蛋白20%以上时，倾向于形成包涵体。其中还包含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋 白分子。 包涵体形式的缺点： 重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效 的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象 的目标蛋白。 2、分泌型异源蛋白的表达 将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 分泌机制 3、融合型异源蛋白的表达 P173 融合蛋白(fusion protein )：将外源基因与受 体菌自身的蛋白编码基因拼接在一起，并作为一个 开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达出 的蛋白质称为融合蛋白。 （1）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化 （2）外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子 （3）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 （4）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺 表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件 溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多有水溶性。 需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。 优点：专一性强，回收率高（可达到85%以上），目的蛋白N端不含甲硫氨酸。 缺点：异源蛋白内部含有甲硫氨酸不能用此方法。 酶促裂解法：单残基位点 4、寡聚型异源蛋