实验8-专酶的分离纯化.ppt

酶化学 主讲教师：王丹 生物技术实验室 酶的概念： 酶是生物催化剂，是活细胞合成的具有高度催化效率和高度特异性的一类蛋白质。 （二）酶具有高度特异性 1．绝对特异性：有的酶只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应生成特定结构的产物，称之为绝对特异性（absolute specificity）。 2．相对特异性：大多数酶作用于一类化合物或一种化学键，这种不太严格的选择性称为相对特异性（relative specificity）。 各种因素对酶反应速度的影响 单分子酶促反应的米氏方程及Km 米氏方程的推导 酶反应速度与底物浓度的关系曲线 酶促反应速度的测定与酶的活力单位 酶活力测定方法 酶活力的表示方法 酶的分离纯化 酶分离纯化的目的 　　酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。 分离纯化过程包括3个基本步骤：1 抽提2 纯化3 制剂 Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984) 某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系(1984年) 在分离纯化中必须注意：1 防止酶的变性失活；2 在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。 第一节 酶活力的测定 几个名词 1 酶活力或酶活性 2 酶活力单位 3 mol催化活性（分子活性）和转换 数（催化中心活力) 4 酶的比活力 酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL) 指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。 酶活力单位(enzyme activity unit) 表示酶活力大小的尺度； 一个国际单位（IU）是指在特定条件下（25 0C），每分钟内转化1?mol底物或催化形成1?mol产物所需的酶量 一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量，1 Kat = 6?107 IU。 mol催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）  mol催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除以n 。 酶的比活力（specific activity)　　酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。 酶活力的测定方法： １终止反应法 ２和连续反应法。 　　　　　终止反应法　　在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。 　　　　连续反应法　　无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。 酶不可逆失活的原因和机理 蛋白质（酶）的失活机理 蛋白质的稳定化 酶分离的一般流程 第二节 酶溶液的制备 酶溶液的制备： 把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。 一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。 微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎后提取 动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料 应去皮等以免单宁等物质着色污染 细胞破碎： 物理和化学两大类方法 1、物理破碎： —研磨（手磨，球磨和石磨）， —机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等）， —高压法， —爆破性减压法， —专用波振荡， —快速冷冻融化法等。 2、化学破碎： —渗透作用 —自溶： —酶处理 —表面活性剂 （I）渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。 （II）自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗