中国海洋大学基因工册程l4第二章pcr技术.pptVIP

第二章 PCR技术 定义：在体外的无细胞体系中模拟天然DNA复制过程的使目的DNA的量增加的反应。 三、PCR反应成分 1、引物(Primer): 15-30nt 设计原则 *引物间 ---ACGC ---GAGC *引物内 --AACTGTT-- *GC% *末端保守性 *兼并碱基 2、 Taq酶 3、Mg2+ 4、模板(Template) 制备和用量 100bp~40kb 实际3~5k 难于得到长扩增产物的原因： *3’错配 *高温下脱嘌呤(depurination)或脱嘧啶(deamination)-Taq不能通过 pH7.0 100°C 1/100kb/min depu-pH6.45 1/20~30kb/min *反应添加剂、PCR循环参数、模板完整性 *Taq酶自动脱落 改进办法: *发展新酶（pfu、Vent双聚合酶-消除错配）or合成能力强酶(Tth) *Tricine（三羟甲基甘胺酸）-pH稳定性 5、PCR buffer Tris.Cl、KCl 6、dNTP 20-200?mol/L 四、平台效应： PCR 反应后期循环产物对数累积趋于饱和，伴随0.3~1pmol靶序列的增加。 *dNTP和引物快速掺入，浓度降低 *酶与模板比例下降 *变性温度高和温度循环，酶活力和dNTP稳定性下降 *非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争 *产物在高浓度时变性不完全，影响引物延伸 *酶与PCR产物结合，使酶浓度下降 五、 PCR反应的质量指标 PCR反应的质量标准有： 特异性（序列选择） 有效性（序列产量） 准确性（序列对错） 上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。 七、PCR技术应用 1、点突变技术 2、锚定PCR（anchored PCR A-PCR） 3、不对称PCR（asymmetry PCR） 引物比例 1：100 4、表达子PCR(expression-cassette PCR ECPCR） 酶切位点 克隆 噬菌体启动子 单链探针 蛋白质结合位点 产物纯化、检测 5、反向PCR(inverse PCR） 6、原位PCR 7、RAPD(Random Amplification Polymorphic DNAs) 原理-引物-条件-应用 8、其它 七、PCR扩增产物的分析 凝胶电泳 杂交 微孔板夹心杂交法（特异性高）:通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物间接地固定于微孔板上，然后，再利用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域的特异性进行一次 杂交，显色后即可判断结果. 颜色互补分析:颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。 单一核苷酸引物延伸法:检测产物是否存在已知点突变-吸附后标记的单核苷酸延伸 列出四种鉴定亲缘关系或进化关系的方法，原理 若可得恐龙的DNA ,如何通过PCR和基因克隆检测恐龙是温血或变温爬行动物 * * 一、PCR技术的诞生与发展 聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。 1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary Mullis发明了具有划时代意义的PCR技术； 1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化； 1993年，Kary Mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖； 1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。 二、原理 循环denature 94 ?C 30Sannealing Tm-5 ?Celongate 72 ?Ccycle 25-35 DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响 DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性