再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特性及其对造三血的影响的研究分析-内科学专业毕对业论文.docx

目 目 录 中文摘要 -1 英文摘要 。5 英文缩写 ·1l 研究论文再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特性及其 对造血的影响的研究 引言 ·l 3 第一部分ATG联合CSA免疫抑制治疗儿童重型再生障碍性的研究 前言日U舌 1l 5一 材料与方法 ·16 结果 19 附表 ： 。22 讨论 24 小结 ·27 参考文献 ·27 第二部分再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特性的研究 前言刚舌 ”．． 3—2 材料与方法 ·33 结果 40 附图 ·43 附表 ·48 讨论 一 49 小结 54 参考文献 r 54 第三部分再障患儿骨髓间充质干细胞生物学特性改变对造血影响的研究 前言月U吾 ·58 材料与方法 58 结果 ··63 附图 ·65 讨论 69 小结 小结 ·72 参考文献 ·72 结论 ·75 综述获得性再生障碍性贫血的免疫异常与造血干细胞缺陷 ··76 致谢 ·98 个人简历 ·99 中文摘要再生障碍性贫血患儿骨髓问充质干细胞生物学性 中文摘要 再生障碍性贫血患儿骨髓问充质干细胞生物学性 及其对造血的影响的研究 摘 要 目的：再生障碍性贫血(简称再障，AA)是儿童常见的难治性血液 系统疾病之～，尤其是重型再生障碍性贫血(SAA)，脏器出血和严重感 染的发生率高。应用抗胸腺细胞球蛋白／抗淋巴细胞球蛋白(ATG／ALG) 联合环孢素A(CsA)的强化免疫抑制治疗(IST)方案的推出，使急性 再障的早期病死率降低，长期存活率及生存质量与造血干细胞移植 (HSCT)相近。然而，无效、疗效延迟出现、复发、日后转变为PNH、 MDS和急性白血病等疾病的几率较高和早期死亡仍是IST显著存在的问 题。这使得我们应进一步探索再生障碍性贫血的完整病因以获得更为有效 的治疗手段。 目前普遍认为免疫异常尤其是淋巴细胞免疫功能紊乱在再障的发病 中起重要作用。除免疫功能异常外，其他机制如造血微环境缺陷及造血干 细胞内在增殖能力受损也有可能参与了再生障碍性贫血的发病过程，越来 越多的证据表明造血微环境对造血过程必不可少【16．I 7】。 骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs) 是构成造血微环境的重要组成成分，骨髓中成骨细胞与脂肪细胞具有同源 性，均来源于BMMSCs。红髓脂肪化是再障最具特征性的病理改变之一。 主要原因是再障患者骨髓中脂肪细胞明显增多。然而到目前为止，再生障 碍性贫血的发病是否与脂肪细胞过度生成或是间充质干细胞功能缺陷有 关尚未明确。是否BMMSCs的分化能力发生变化，导致其向成骨、成脂 肪分化的平衡失调，从而骨髓中BMMSCs成脂增多，再障患儿出现骨髓 脂肪化这～特征性病理改变?我们假设如果BMMSCs发生改变，使其向 脂肪细胞的转化增加，那么成骨细胞的生成则会减少，而基于成骨细胞龛 在造血中的重要地位，在造血微环境中，BMMSCs及其分化成的细胞对 造血的影响及相互关系目前的研究尚未明确。 本课题回顾性分析了我院小儿科重型再障(SAA)患儿应用ATG联 合联合CsA免疫抑制治疗(IST)取得的临床疗效、不良反应、治疗前后 中文摘要外周血三系及T细胞亚群的变化情况，进一步探讨了IST的患儿造血功 中文摘要 外周血三系及T细胞亚群的变化情况，进一步探讨了IST的患儿造血功 能恢复的情况；同时完成SAA患儿BMMSCs的分离培养及纯化，检测 AA患儿的BMMSCs在增殖、分化及凋亡等方面的变化，并检测其可能 的作用机制，此外，进一步探讨BMMSCs的生物学特性改变对造血的影 响，从另一个研究思路探讨AA发病的机制。以指导临床上对不同致病原 因的患儿采取不同的治疗方法。 方法： l回顾性分析我院1996年6月一2010年11月收治的应用ATG联合 CsA免疫抑制治疗SAA和vSAA患儿24例。所有患儿均给予兔．ATG[4．5 me=／(kg‘d)x5】，同时给予CsA口服，初始剂量3-5 mg／(kg-d)。治疗 前清除感染灶，积极防治过敏反应，密切观察治疗前后临床表现的改善及 血常规的恢复规律，以及用药期间的不良反应反射率等情况。 2分离培养扩增AA患儿的BMMSCs：以正常人作为对照组，观察 AA患儿BMMSCs的原代细胞培养及扩增传代的特点。 3选取生长状态良好的P3代细胞，瑞氏吉姆萨染色后固定，显微镜 下比较AA患儿和正常人BMMSCs的形态差别。 4 MTT法测定AA患儿BMMSCs生长曲线。 5加入分化诱导液对比AA患儿和正常人BMMSCs成脂分化能力的 差异。 6 RT-PCR和免疫组织化学方法比较AA患儿与正常人BMMSCs成脂 分化的标志基因PPAR2基因水平及蛋白水平的表达情况，了解有无差异。 7建立BMMSCs与K562细胞的