水稻组自织培养.pptVIP

水稻组织培养 实验原理 植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性，细胞全能性(toti potency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个完整机体的全套基因，在适宜的条件下，细胞具有形成一个新的个体的潜在能力。 材料 选取水稻种子( 干种子或是湿种子均可)作为植物组织培养的外植体 仪器 电子天平、酸度计、微量移液器、电炉、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、超净工作台、剪刀、镊子、照度计、摇床、灭菌锅 培养基母液配置 大量元素母液配制: ①母液 A1( 浓缩10倍) : 称取KNO3 19g、NH4NO3 16.5g、MgSO4·7H2O 3.7g、KH2PO4 1.7g，分别溶解后混合并定容至 1000ml，4℃保存备用; ②母液A2（浓缩10倍）：称取CaCl2·2H2O 4.4g 定容至1000ml，4℃保存备用。 微量元素母液配制( 母液 B，浓缩 100 倍) 称取 MnSO4·4H2O 2.23g、ZnSO4·7H2O 860mg、H3BO3 620mg、KI 83mg、NaMO4·2H2O 25mg、CuSO4·5H2O 2.5mg、CoCl·6H2O 2.5mg，分别溶解并混合后定容至1000ml，4℃保存备用。 铁盐母液配制( 母液C 浓缩 100 倍) : 称取Na2-EDTA 3.77g、FeSO4?7H2O 2.78g、分别溶解并混合后定容至 1000ml，4℃保存备用。 有机物质母液配制( 母液 D，浓缩50倍) : 称取甘氨酸 100mg、盐酸硫胺素20mg、盐酸吡哆素25mg、烟酸E25mg、肌醇 5000mg，分别溶解后混合并定容至 500ml，4℃保存备用。 生长调节物质母液配制: 为了操作方便，生长调节剂也可先配制成母液(药品在配制时若不溶于水，可用少量溶剂先溶解，如萘乙酸 （NAA），吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），2,4-D等生长素和玉米素（ZT） 可先用少量 95％ 酒精溶解，然后加水，若溶解不完全再加热; 激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量 1mol/L 的 HCL 中，叶酸需用少量稀氨水溶解称取 50mg 生长调节物质，溶解后，蒸馏水定容至 100ml，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，4℃保存备用。 MS固体培养基的配制及灭菌 取 1000ml烧杯一只，加 500ml 水，然后加琼脂 10g，放至电炉子上( 铺有石棉网) 加热，边加热边搅拌至琼脂完全溶解(然后加蔗糖或白糖) 30g 搅拌至其溶解; 分别称取母液 A1 100ml、母液 A2 100ml、母液 B 10ml、母液C 10ml、母液D 10ml，到此烧杯中，搅拌均匀后用 0.5mol/L HCL 或 0.5mol/L 的 NaOH将培养基 PH 调至 5-8左右。 不同培养阶段所需要的生长调节物质有很大的不同，因此不同阶段的培养基中要加入的生长调节物质是不一样的，如愈伤组织诱导培养基（MS+2,4-D2.0mg/L）中2,4-D为每升2.0mg，而2,4-D母液的浓度为0.5mg/ml，则配制时要从其母液中吸取4mL。培养基配制好后，将其分装至150mL三角瓶中，每瓶40mL左右。用两层牛皮纸或硫酸纸将装好培养基的瓶口包裹住，用3个乳胶圈将瓶口封紧即可灭菌。培养基的灭菌条件为121℃，25min左右，灭菌时要将无菌操作的所需的备品灭全，包括剪刀、镊子、刀片、无菌水、报纸或滤纸等。 外植体的表面消毒及接种 选取饱满成熟的水稻种子，手工剥去颖壳，选取干净完整的颖果(在超净工作台内，先用 75％酒精处理 30s，再用 0.1％升汞处理 10min 或 2％次氯酸钠溶液 15min，然后用无菌水冲洗 5~6次(用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干，然后用镊子夹取水稻种子轻轻放到愈伤组织诱导的培养基表面，每瓶 5 粒左右(每接 5 瓶左右，用75％ 酒精擦拭手和台面，进行消毒。 不同培养阶段的培养基配方及培养条件：愈伤组织诱导和继代培养基为MS +2,4一D 2.0mg/L，培养条件为黑暗培养，温度控制在26(±1)℃;愈伤组织分化芽培养基为MS +6一BA 2. 0 mg/L + NAA 0. 2mg/L，光照强度为3000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(±1) ℃;生根培养基为1 /2MS + NAA 1. 0 mg/L，光照强度为4000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(±1)℃。 实验结果 根据上述培养基配方所建立起来的水稻植株再生体系，愈伤组织诱导率)芽分化率及生根率均较高。水稻种子在诱导培养中培养10天左右，从水稻芽的基部长出淡黄色)呈细小颗粒状的愈伤组织( 图 A) 将愈伤组织转入分化芽