龙军真菌讲稿.pptVIP

1 . 分子生物学技术 目前缺乏标准化的方法 WHite运用实时定量PCR方法对203例血液病患者全血标本进行曲霉检测，结果发现在确诊/高度拟诊的患者中，阳性率为92.3%;与G实验和GM实验及高分辨CT有良好的一致性 分子生物学技术 台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS) ，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97% ， 1天内完成 J Clin Mic 2005,43:3760-3768 分子生物学技术 存在问题 1.外来的污染 2.不能有效地区分定植和感染 3.不能指导临床何时开始及停止抗真菌治疗 真菌的病理检查 真菌的病理检查 真菌的病理检查 真菌的病理检查 组织病理学检查 侵袭性曲霉感染： －侵犯血管，引起病变部位的栓塞、出血及坏死 －非特异性炎症、化脓性改变或肉芽肿形成 组织病理学检查 组织内曲霉： －镜下菌丝常呈45°分枝、有隔、透明且粗细均匀,直径约3～6μm ,有菌丝反复分枝现象，排列成放松射状或珊瑚状。 －有些慢性损害中菌丝常呈不规则扭曲状 －特征性的菌丝：诊断曲霉感染最可靠的依据 组织病理学检查 HE染色呈蓝色略带红色，PAS染色呈红色 嗜银染色呈黑色 菌丝横切面与孢子的鉴别： －孢子往往成群分布，直径小于菌丝 毛霉菌的实验室诊断 与外界相通部位分离出毛霉菌不一定有意义 无菌部位标本阳性培养有意义 支气管肺泡灌洗液直接镜检—常用 分子生物学技术 真菌药敏判断标准解读 抗真菌药物敏感试验 过去试验方法及存在问题 液基稀释法(broth dilution) 微量液基稀释法(broth microdilution) 琼脂混合法（agar incorporation） （即过去广泛使用的药基法） 琼脂扩散法(agar diffusion) 问题：影响因素过多，结果重复性差 NCCLS M27-A方案 酵母菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案 （Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts） 已批准的标准方法，包括微量稀释法（microdilution) 主要适用于：念珠菌和新生隐球菌 2002年出版了M27-A2方案 NCCLS M38-P 方案 产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案（Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidia-Forming Filamentous Fungi） 提出的标准方法，微量稀释法 主要适用于：如曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克孢子丝菌（菌丝相）等。 我们已根据此法，进行了皮肤癣菌的药敏试验 2003年推出M38-A方案 M44-A方案 2004年CLSI出版了对酵母菌的纸片扩散法抗真菌药物敏感试验参考方案 使用美蓝MH琼脂平板，纸片为Rosco公司生产的各种抗真菌药物纸片 M27-A2药敏判读 对于酵母菌（念珠菌、新型隐球菌，不适用于其他真菌）： 氟康唑:35度、40-50h(隐球菌70-74h) ，与生长对照菌比较80%受抑制为判定点 如MIC≤8μg/ml报告敏感， ≥64μg/ml报告耐药， 16-32μg/ml则是剂量依赖敏感 光滑、克柔不适用 M27-A2药敏判读 伊曲康唑的MIC定义同氟康唑 如MIC ≤0.125μg/ml,提示受试黏膜感染的念珠菌敏感，如≥1μg/ml报告耐药 0.25—0.5μg/ml提示为剂量依赖敏感 目前无黏膜外的侵袭性念珠菌感染的折点判定标准 M27-A2药敏方案的临床意义1） 耐药菌株的鉴定与监测： ? 念珠菌对FCZ的耐药问题日益严重 ? AIDS患者经FCZ治疗后出现较多白念珠菌的耐药株 ? MIC值升高，随FCZ剂量增大 ? 分子生物学方法可证实同一菌株产生耐药 M27-A2药敏方案的临床意义(2） 拓展新的药敏试验方法： ? 微量稀释法、E-test法等均以M27-A为基 础，从不同角度为临床提供更简捷，易推 广的药敏试验技术 M27-A2药敏方案的临床意义(3) 应用于抗真菌新药的研究 ? 评估新的抗真菌药物的抗真菌效果 ? 扩展到丝状真菌药敏试验 ? 以此为基础，对曲霉、镰刀霉、根霉、波氏霉样真菌、孢子丝菌已形成M38-A方案（200