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ENCODE DNA元件百科全书 ENCODE ①）由美国国家人类基因组研究所在2003年9月发起的一项公共联合研究项目 ② 目标：旨在找出人类基因组中所有功能组件，系统建立人类基因组中的功能元件，其中包括在蛋白质水平和RNA水平上的元件，以及当基因激活时，控制细胞和环境的调控元件 ③DNA元件百科全书（英语：Encyclopedia of DNA Elements，简称为ENCODE计划。 2012年9月5日，该项目的初步结果被整理为30篇论文并发表于《自然》、《基因组生物学》及《基因组研究》中[6][7]。这些发表的论文显示人类基因组内的非编码DNA至少80%是有生物活性的，而非像之前认为的仅仅是“垃圾”。结果非常重要，因为人类基因组中98%的DNA是非编码的，意味着它们并不直接编码任何蛋白质序列。 研究内容 1.找出人类基因组中所有功能组件 2.发现和注释基因原件 ①测序大量的RNA资源 ②比较基因组 ③整合生物信息学方法 ④人力管理 3.调节元件分析 ①DNA高灵敏度分析 ②DNA甲基化分析 ③蛋白质的免疫共沉淀：DNA与RNA的相互作用 ④修饰组蛋白 ⑤转录因子 ⑥染色质调节子 ⑦RNA结合蛋白 ⑧测序 实验技术 一、CHIP-Seq(染色质免疫沉淀-测序） 二、各种测序文库构建方式 三、RNA-Seq 一、染色质免疫沉淀-测序（ChIP-Seq） 1.概述 ①染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP） 也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。 2.原理 ①首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建； ②然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。 研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。 3.步骤流程 4、生物信息分析流程示意图 1）．测序 ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。 2）．基本数据分析 数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。 3）. 高级数据分析 标准高级数据分析内容包括： （1）ChIP-Seq序列与参考序列比对； （2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）； （3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度； （4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释； （5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。 二、各种测序文库构建方式 1、目的：基因组DNA文库用途十分广泛，如用于人类及动植物基因组学研究，基因表达调控研究，分析、分离特定的基因片段等。 2、基本流程可以归为四大步骤： ①分离基因组DNA ②对基因组DNA作相关的处理、 ③将基因组DNA片段连接入载体、 ④将重组载体转入宿主细胞。 3.目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。 在基因组De Novo测序过程中 ①Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp→经常用于基因组骨架的组装 ②SolexaABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap 4.下面以solexa为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 1）单端测序(Single-read) ①DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段 ②引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头 ③将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 2）Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 5、选择合适的载体 1