离心分离前和沉淀分离.pptVIP

离 心 分 离 0 概述 固液分离的常用手段 分类： 1 离心沉降原理 1 离心沉降原理 离心机的种类与用途 平抛式离心机转子 2 离心沉降设备 瓶式离心机 2 离心沉降设备 管式离心机 2 离心沉降设备 碟式离心机 2 离心沉降设备 3 离心沉降的计算 管式离心机 沉 淀 分 离 概述 沉淀（定义） 是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 沉淀具有选择性 有选择地沉淀杂质 有选择地沉淀所需成分 概述 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 蛋白质的溶解特性 蛋白质是两性高分子电解质 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 概述 沉淀法操步骤 ： 概述 蛋白质盐析 蛋白质盐析 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 蛋白质盐析 盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 蛋白质盐析 盐析操作 蛋白质盐析 阴离子： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3- 阳离子： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。 蛋白质盐析 影响因素 蛋白质盐析 盐析注意事项： Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 ㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率 等电点沉淀法 原理： 等电点沉淀法 等电点沉淀实例 等电点沉淀法 细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 低温离心 上清液调 pH4.8- 5.1 产物↓ 沉淀（杂蛋白） 有机溶剂沉淀法 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂沉淀法机理 A 降低溶剂介电常数. B 破坏水化膜： C 相反力： 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 容易获取 　沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 有机溶剂沉淀法的影响因素 温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓ * pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 ~ 6.0 lgS (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度 调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀