第二章军基因工程的酶学基础.pptVIP

工具酶种类: Restriction endonuclease DNA ligase DNA polymerase DNA prosessing enzyme （5）识别位点在DNA分子中的频率 假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷酸有一个识别序列。 λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ ）个切割位点？ 理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为 （ ）。 （6）II型限制性内切酶酶解反应的条件 大部分需要相似的反应条件 Tris-HCl 50mM pH7.5 MgCl2 10mM 0-50mM 低盐酶 NaCl 0-150mM 50-100mM 中盐酶 DTT（二硫苏糖醇 ）1mM 100-150mM高盐酶 Volume 20-100ul T 37℃ 1 hr 二、平头双链DNA片段的连接操作 用末端转移酶在载体和双链DNA的3端各加一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 如dA(dG)和dT(dC)。 三、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 碱性磷酸酶：来自于小牛胸腺（CIP）或大肠杆菌（BAP），用于去掉DNA or RNA分子的5’端的磷酸基团。 练习题 1.什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾? 2.何谓接头连接法(1inker ligation 3.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 4什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应? 衔接物连接法（linker） 衔接物（linker）：用化学方法合成一段由10-12bp核苷酸，组成具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。 原理：（1）T4DNA连接酶连接linker与克隆DNA片段。 （2）限制性内切酶消化具有衔接物的DNA分子和载体分子，产生出互补粘性末端，进行粘性末端的连接。 接头连接法（adapter） 接头（adapter）：人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 原理：接头平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 DNA重组连接的方法大致分为五种： (1)___(2)___(3)____(4)____（5）______。 第三节 DNA聚合酶(DNA polymerase) 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNA polⅠ) 2. Klenow fragment 3. T4 DNA聚合酶 4. 逆转录酶 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）性质： 3’-5’的核酸外切酶活性 5’-3’的DNA聚合酶 5’-3’的核酸外切酶活性 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸片段。 （2）基本用途：用DNA聚合酶I 制备探针 标记 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交 nick 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 利用DNA聚合酶I 的5’?3’外切酶活性和5’?3’的聚合酶活性。 ?切口平移(nick translation)法标记DNA： nick ?-32P-dNTP DNaseⅠ 2. Klenow fragment 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。 （1）Klenow fragment的性质 DNA Pol I ? Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶 ① 3’端补平 5’ 5’ klenow ② DNA 3’末端标记 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端 （5’粘性末端）。 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow （2）主要用途 ③ cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 ④双脱氧末端终止法测定DNA序列 （1） T4 DNA聚合酶的性质 3. T4 DNA聚合酶 5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。 ①酶活性 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ T4 DNA聚合酶 无dNTPs T4 DNA聚合酶 有dNTPs 5’ 5’ 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。 ② 特点 （2