高山红景天叶肉原生质体的分离培养与植株再生.pptVIP

高山红景天 高山红景天： 为景天科红景天属多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能。 一 材料和方法 1.材料 2. 原生质体分离： 取材：幼嫩叶片(长 0.5～3 ）切成宽1.0～2.0 mm 的条状 酶液配制：0.5 %～2 %纤维素酶 + 0.3 %～1 %果胶酶 + 10 mmol/ L CaCl2 ·2H2O + 0.1 %MES + 0.7 mmol/ L KH2 PO4 + 0.4～0.6mol/ L 甘露醇, p H = 5.8 酶解处理：以1 ∶10 的量将材料放入酶液。于25 ℃,黑暗条件下振荡酶解1～5h ,转速为80 r/ min 。 3.原生质体纯化： 酶解后的原生质体和酶混合液经250 目的尼龙网滤过后以800 r/ min 离心8min 沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加入洗涤液和液体培养基各清洗1 次备用。 洗涤液：10mmol/ L CaCl2 ·2H2O + 0.1 % MES + 0.7mmol/ LKH2 PO4 + 0.4 mol/ L 甘露醇, p H = 5.8 液体培养基：1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 0.5 mg/ L ZT + 0.5 mol/ L 甘露醇 + 5 00 mg/ L 水解酪蛋白。 4. 原生质体存活率及产量的测定： 活力测定:采用EvansBlue 染色法，存活率= (未染蓝细胞数/ 细胞总数) ×100 %。 原生质体产量:用血球计数板进行计数,以每克鲜质量组织获得的原生质体个数(个/ g) 来表示. 5. 原生质体培养： 将原生质体密度调到210 ×105 个/ mL , 转入原生质体液体培养基中进行液体浅层黑暗静置培养。在培养过程中每10 d 以3 ∶1(原生质体培养基∶无渗透压调节剂培养基) 比例加入无渗透压调节剂培养基,逐步降低渗透压。 6.愈伤培养与植株再生: 当多细胞团进一步增大,形成肉眼可见的小愈伤组织时,挑出并转移到愈伤组织培养基MS + 6-BA 2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L ,转为光照培养之前,首先经过2～3 d 的弱光培养锻炼阶段,然后转入光照培养,继续培养约1 个月时间。 经3 次继代培养后,挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基MS + 1 mg/ L 6-BA + 0.1 mg/ L NAA ,待小芽长至2.0 cm 左右,切下转入生根培养基上形成完整植株,生根培养基为1/ 2MS。培养基p H = 5.8-6.0 ,琼脂6 g/ L ,蔗糖25 g/ L ,在1.2 kg/ cm2压力下灭菌20 min ,培养温度(25 ±2) ℃,光照强度为2 000～3 000 lx ,每天光照12 h 。 二、结果与分析 1.光照与黑暗 结果表明：在相同酶解条件下，光照与黑暗处理对高山红景天原生质体产量间差异不显著，因此，在进行原生质体分离以前，对组培苗是否光照不是影响原生质体产量的关键因素。在此实验中，直接采取没有进行黑暗预培养的组培苗进行原生质体分离。 2.叶片大小 在相同酶解条件下，长度大于1.5cm的叶片原生质体产量显著高于长度小于1.5cm的处理，因此，选用长度大于1.5cm的叶片为宜。 3.酶类组合 纤维素酶与果胶酶组合 各处理存活率大小顺序为:1 4 5 2 7 3 8 6 9 各处理产量大小顺序为: 5 3 6 2 7 4 8 1 9 综合来看，处理5的产量显著高于其他处理，因此，采用处理5 的酶液组合（1%纤维素酶 + 0.5%果胶酶）可获得最大存活原生质体产量。 4.酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景天原生质体产量的影响： 时间影响：1~4 h随酶解时间的延长，原生质体产量递增，在4 h时达到最高值，以后随时间的延长，产量下降。 酶解后期的产量和存活率下降，是由于酶解液长时间浸泡造成部分原生质体破裂和损伤引起的。 酶液中甘露醇对原生质体产量和存活率的影响： 酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的处理经纯化后呈圆球型，可观察到大量叶绿体的存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇用于维持原生质体渗透压效果较好。 高山红景天原生质体培养与植株再生： 将纯化的原生质体密度调到2×105个/mL,在黑暗条件下进行液体浅层培养，经3天可见第一次细胞分裂，约40d时，可形成肉眼可见的愈伤组织。经过2~3d 的弱光培养，将愈伤组