结核分枝杆菌rv3717基因的克到隆 表达及功能鉴定.docxVIP

大连医科大学 硕士学位论文 结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定 姓名：陈燕 申请学位级别：硕士 专业：人体解剖与组织胚胎学 指导教师：辛毅 201106 结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定硕士生姓名： 结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定 硕士生姓名： 陈 燕 指导教师： 辛毅教授 指导小组： 马郁芳教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘要 结核分枝杆菌是全球主要的病原体之一，随着多重耐药菌株的增加，其威胁 性也随之增大。结核分枝杆菌的细胞壁相对较厚、硬并且具有疏水性，能够有效 地保护细菌，因此抗菌药物的开发具有较高的难度。 乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)，是一种一线抗结核的药物。本课题利用生物信 息学的方法，发现一种未知功能的基因Rv3717。当乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌 后，Rv3717基因的表达上调。该基因被预测具有水解肽聚糖的功能，可能会造成 肽聚糖的水解，引起细胞的自溶。 肽聚糖是结核分枝杆菌细胞壁核心结构的重要组成部分，目前关于分枝杆菌 细胞壁自溶素(也称为肽聚糖水解酶)的了解并不多。已知枯草芽孢杆菌的cwlB 基因是一种已知的细胞壁自溶素，把此基因的序列与结核分枝杆菌的基因组序列 进行BLAST比对，找到两种同源基因Rv3915和Rv3717，推测该两种基因表达的 蛋白质可能同样具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明，Rv3915基因被成功克隆 表达并且经鉴定具有肽聚糖水解酶的活性。因此，Rv3717基因是否也有此活性是 本课题所要解决的问题。 对Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的确定，有利于揭示EMB抗结核的作用机 制，并为发现新的药物靶点进而开发新一代抗结核药物提供理论依据。 目的：通过对Rv3717目的基因的克隆表达，纯化目的蛋白，以对Rv3717基 因的功能进行鉴定。 方法：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，利用PCR技术进行目的基因的 扩增。使用克隆载体pMDl8．T与目的基因以‘‘A．r连接方式构建克隆质粒 pMDl8．Rv3717；被扩增的目的片段经测序正确后，载体和目的片段分别经双酶切 后进行连接，构建表达质粒。利用不同的载体和不同的宿主菌，通过调节诱导剂 的浓度和诱导温度等进行目的蛋白的优化表达。利用SDS．PAGE和Western blotting 检测目的基因的表达，利用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化并用酶谱法对目 的蛋白进行功能的检测。 结果：构建了克隆质粒pMDl8．Rv3717；扩增的目的基因经测序正确后，构建 结果：构建了克隆质粒pMDl8．Rv3717；扩增的目的基因经测序正确后，构建 了无突变碱基的表达质粒pET29b．Rv3717和pETl6b．Rv3717。表达质粒 pET29b．Rv3717在所使用的各种宿主菌中的蛋白表达量极低。表达质粒 pETl6b-Rv3717在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量高，但是绝大部分是以包涵 体的形式存在，上清液中的可溶性目的蛋白比较少。目的蛋白的上清液经镍柱纯 化以后，得到含有少量杂蛋白的目的蛋白的纯化物。纯化的目的蛋白没有检测到 肽聚糖水解酶的活性。 结论：利用分子克隆技术克隆了结核分枝杆菌的基因Rv3717；使用表达质粒 pETl6b在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达了目的基因，并且绝大部分目的蛋白是 以包涵体的形式存在。本论文论述了目的基因Rv3717与肽聚糖水解酶的关系，未 能检测出过表达的目的蛋白的肽聚糖水解酶的活性，但为进一步地探讨两者之间 的关系提供了方法学的借鉴和物质基础。 关键词：结核分枝杆菌乙胺丁醇肽聚糖水解酶Rv3717 2 Cloning，expression Cloning，expression and characterization of Rv3717 gene from M．tuberculosis Graduate student：Yan Chen Advisor：Professor Yi Xin Co—advisor：Professor Yufang Ma Major：Biochemistry and Molecular Biology Abstract Mycobacterium tuberculosis叫．tuberculosis)is one of major global pathogens and its threat has increased、析tll the emergence of multidrug—resistant strains．The cell wall of M．tuberculosis is thick，rigid，and hydrophobic，and it serves to protect