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第十五章基因技术 哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 高旭 刘兴汉 一、基因工程的基本概念 （一）重组DNA技术 （recombinant DNA technology） 是指在体外按人们的意愿将不同的 DNA分子重组的技术。 二、基因工程操作中常用的工具 (一)工具酶 (二) 载 体 2. 其他相关酶类 T４ DNA连接酶用于互补粘性末端和 平端DNA分子之间的连接。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5‘→3’的聚合 作用，5‘→3’外切作用和3ˊ→5ˊ的外切作用。 逆转录酶是以mRNA为模板合成互补DNA即cDNA，用于组建cDNA基因文库。 T４多核苷酸激酶能催化ATP的γ-磷酸 转移到DNA或RNA的5‘端羟基上。 碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除DNA或RNA5‘端的磷酸产生5’端羟基以 防止载体的自身连接。 末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转 移到DNA的3‘端的羟基上。 基因工程中使用的质粒具备的特点 质粒的复制型 分为松弛型和严谨型两类。 质粒的不相容性 作为载体的质粒一般是不相容的。 质粒的接合性 用作载体的质粒都是非接合性质粒。 多克隆位点 即多种限制性内切酶的单一识别序列。 筛选标记 常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和 蓝白菌落筛选标记。 3. 粘粒 (cosmid) ： 4.病毒（virus） 三 、基因工程的操作过程 （一）目的基因的获得 （二）目的基因与载体的连接 （三）重组体导入受体细胞 （四）基因工程菌的筛选 （五）外源基因的表达 1. 同源粘性末端连接 方式：同一限制酶切割位点连接配伍末 端连接 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶产生的平端切割 粘性未端或切平形成的平端 3. 定向连接 适用于：两种不同的粘性末端 一个粘端，一个平端 探针标记方法 （一）同位素探针： 32P:常用，灵敏度高，半衰期短，穿透力强 3H：分辨力高，半衰期长，适合原位杂交 35S:标记蛋白，也可用S取代磷酸中的O (二)光敏物质 （三）酶促生物素 （三）地高辛 （四）分子信标：荧光标记 提取DNA或RNA，直接点在硝酸纤维素膜上，和探针杂交 检查有没有目的DNA或RNA。 DNA点阵: 将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测DNA或RNA和那一个探针杂交。 待检样品进行标记 一种样品多种探针 基因芯片： 将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测未知的DNA或RNA和哪一个探针杂交。 （二）原位杂交 1.组织切片或细胞涂片原位杂交： 将DNA或RNA在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交，确定DNA或RNA在组织和细胞中的定位。 2.菌落或噬菌斑原位杂交： 基因工程中筛选阳性克隆。 3. 转移印迹技术： 先用电泳将DNA或RNA条带分开，再转移到硝酸纤维素膜上，与探针杂交，鉴定待测DNA或RNA。 Southern blotting: 检测DNA Northern blotting: 检测RNA Western blotting: 检测蛋白质，因要用抗体检测，也叫免疫印迹（Immunoblotting） 在众多样品中哪一个是目的DNA、RNA 或目标蛋白质。 PCR是一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，也叫基因扩增技术，类似体内的DNA复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性，在一对引物间诱发聚合酶反应。 PCR具有特异性强，灵敏度高，操作简便，对待检材料质量要求低等特点，能够快速扩增任何目的基因。 一 、转基因动物 将外源基因导入动物的受精卵， 再将受精卵植入到代孕动物的 输卵管或子宫中培育的动物。 （二）应用 1. 能够创造医学研究需要的动