脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用的研究.docVIP

脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用的研究 ［摘要］目的观察脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮的保护作 用。方法雄性SD人鼠随机分为假手术组、脑损伤组和黄体酮治疗组， 大鼠脑损伤模型制作是利用改良的Feeney 口山落体损伤装置。各组于伤 后24、48、72 h取材。用免疫组织化学法观察大鼠皮质和海马CA1区半 胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)的表达水平变化。结果 脑损伤 组的Caspase-3阳性细胞数在皮质和海马CA1区较假手术组显著增加，黄 体酮治疗组与脑损伤组比较，Caspase-3阳性细胞数明显减少，差界有统 计学意义(P〈0. 05)。结论黄体酮抑制脑损伤后Caspase-3的表达可能 是黄体酮脑保护作用机制之一。 ［关键词］黄体酮；脑损伤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 ［中图分类号］651. 1+5 ［文献标识码］A ［文章编号］1674-4721 (2014) 11 (a) -0012-03 脑损伤是严重危害人类健康和威胁生命的疾病之一。脑损伤后的继发 性损伤以往认为主要是神经细胞水肿和坏死，近年发现创伤性脑损伤后存 在10%?50%的细胞凋亡，而且主要存在于皮质和海马等部位。半胱氨酸天 冬氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)处于细胞凋亡过程中的关键地位，是细胞 凋亡过程的最终执行者［1］,在脑损伤后各种病理因素作用下，Caspase-3 被激活，通过作用于底物引起细胞凋亡。对脑损伤后的继发性损伤，目前 尚无有效的治疗药物。近年研究发现，黄体酮(progesterone, PROG)作 为一种神经當体激素，在体内、体外等多种实验中已经证实具有脑损伤保 护作用[2],但PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。本实验通过建 立Feeney自由落体大鼠脑损伤模型，利用免疫组织化学技术，探讨PROG 对大鼠脑损伤后Caspase-3表达的影响，以阐明PROG对脑损伤的保护作 用。 1材料与方法 1.1实验材料及仪器 恒冷箱组织切片机，CM 1900型，德国Leica公司；Olympus显微摄影 装置,PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG试剂，购自Sigma公司； Caspase-3 —抗试剂，购自武汉博士德公司。 1.2实验分组 雄性成年SD大鼠54只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司， 体重250-300 go实验动物随机分为3组：假手术组18只、脑损伤组18 只、PROG治疗组18只；每组乂分为24、48、72 h 3个时间点检测细胞凋 亡的变化。 1. 3动物模型 采用改进的Feeney自由落体方法建立大鼠创伤性脑损伤模型。麻醉 采用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切开头皮，打开直径5 mm的骨窗，其 位置在矢状缝后1.5 mm,中线旁2. 5 mm处；自由落体重锤质量40 g,从 25 cm处高度自由落下造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，在相同位置开 同样大小的骨窗。PROG试剂溶解于22. 5% 2-轻丙基-0-环糊精溶质中， PROG治疗组伤后1、6 h腹腔注射PROG 16 mg/kg以利于快速吸收，接下 來连续每天1次皮下注射。 1.4免疫组织化学检测 分别于伤后24、48、72 h 3个时间点，对大鼠脑组织进行甲醛灌注, 并且取材固定，自视交叉后做片厚5 uni的冠状切片待用。Caspase-3免 疫组织化学检测采用SP法，按照免疫组织化学法说明书加入一抗和二抗 等操作。切片在400倍光镜下观察，利用免疫组织化学CMIAS真彩色医学 图像自动分析系统进行阳性细胞计数，以5个视野的平均值代表各区计数 结果。 1.5统计学处理 数据采用SPSS 16. 0软件进行统计分析，计量资料用均数土标准差（x ±s）表示，采用方差分析，以卩〈0. 05为差异有统计学意义。 2结果 假手术组少见Caspase-3表达，脑损伤组伤灶周围皮质和海马CA1区, 可见大量Caspase-3阳性细胞表达；与假手术组比较，脑损伤组的 Caspase-3阳性细胞表达明显增高，差异有统计学意义（P0. 05）；黄体酮 治疗组在损伤的周围皮质和伤侧海马CA1区Caspase-3表达与脑损伤组比 较明显减少，差异有统计学意义（P〈0?05）（表1）。 3讨论 随着社会的发展，脑损伤患者逐年增多。发达国家的颅脑损伤年发生 率高达（150?250） /10万人；我国颅脑损伤的年发生率为（100?200） /10万人，直接和间接经济损失高达数百亿元。脑损伤可以分为原发性损 伤和继发性损伤，原发性损伤无法恢复；而继发性损伤通过钙超载、兴奋 性神经递质的释放、脂质过氧化反应、自由基产生、炎症反应等多种因索 加重脑损伤，进而影响神经功能［3-4］ o英中细胞凋亡在继发性脑损伤中 扮演重要角色［5-6］, Casp