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萤火虫发光 第五章 分子发光分析法 第一节 荧光分析法 第二节 磷光分析法 第三节 化学发光分析法 第一节 荧光分析法 一、概述 16世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质会发光，当光照停止时，物质发光会停止。 1852年斯托克斯（stokes) 进行了解释。 1867年Goppelsroder应用铝-桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。 现在已是一种重要的方法 王伦教授 国家自然科学基金 生物大分子有机纳米荧光探针的制备及其应用（国家自然科学基金） 基于纳米材料的荧光共振能量转移体系的研究及其在喹诺酮类药物残留检测中的应用（国家自然科学基金） 朱昌青 物种敏感量子点新型荧光探针的制备及应用 () Fluorescence enhancement method for the determination of nucleic acids using cationic cyanine as a fluorescence probe。Analyst，2004, 129: 254-258 二、基本原理 当一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发轨道上，也可能跃迁到能级更高的单重态上。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态，辐射跃迁主要包括荧光、延迟荧光或磷光的发射。 2.激发态→基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量 ； 振动施豫(VR): 同一电子能级中，电子由高振动能级转移至低振动能级而将多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为10-12s。 内转移：当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 外转移：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移而去活的过程称外转移。 体系间跨越跃迁：指不同多重态间的无辐射跃迁。 磷光发射：由第一激发态（单重）的最低振动能级有可能以系间窜跃的形式转至第一激发三重态，通过振动施豫转至其最低振动能级，因此激发态跃回至基态时便发射磷光，10-4-100s，这种跃迁所发射的光在光照停止一段时间后仍可持续一段时间 。 辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 ? ′2的荧光 10-7～10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；? ′2 ? 2 ? 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100s 。 光照停止后，可持续一段时间 (二) 荧光效率及其影响因素 1.荧光量子产率（荧光效率） 荧光效率 2、荧光与分子结构的关系 （1）具有共轭双键体系的分子 φ=0.28 0.68 （2）具有刚性平面结构的分子 （3）取代基效应 a.给电子基团常常使荧光增强。如-OH,-OR,NH2,-NHR等。 b.吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。-COOH,~C=0,-N02 等 3 环境因素对荧光的影响 1.溶剂极性的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂增强，对激发态会产生更大的稳定作用．结果使物质的荧光波长红移．荧光强度增大． ２．溶液pH对于荧光强度的影响 pH 的影响 （三）溶液的荧光强度 荧光强度与溶液浓度的关系 又根据朗伯比耳定律： ：  （四 ）溶液的激发光谱和发射光谱 荧光光谱 激发光谱曲线  三、荧光分析仪器 四 荧光分析的应用 (一) 无机化合物的分析 有机试剂分析进行分析的元素近70种 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 某些无机化合物荧光测定一览表 (二)有机化合物的分析 第二节 磷光分析法 一 概述 二 基本原理 (一) 磷光的产生和磷光强度 IP= 2.3?pI0?bC =Kc式中： ?p 为磷光效率 I0 为激发光的强度。b 试样池的光程 (二）温度对磷光强度的影响 低温有利于磷光的产生。 （三）重原子效