第四章动物细宏胞培养改.ppt

第四章 动物细胞与组织培养 动物细胞培养、组织培养和器官培养 动物细胞培养指将动物的某一组织取出，分散成单细胞，在人工培养条件下使之存活、生长和增殖的技术； 动物组织培养指从动物体内取出组织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存和生长，并维持其结构和功能不变的技术；（生长晕，outgrowth，组织周围形成的单层贴壁生长细胞） 器官培养：模拟体内生理环境，将整个器官、器官的部分或器官的原基进行培养，使之在体外存活、生长和保持一定功能的技术。（维持其结构和功能不变，维持细胞的分化状态） 动物细胞培养技术的应用： 一、动物细胞工程史 二、动物细胞的特点 三、动物细胞培养方法 四、影响动物细胞生长的环境因素 五、动物细胞大规模培养 六、组织工程 七、器官培养 八、干细胞 一、动物细胞工程史 1.起始阶段 1907年，美国的Harrison(哈里森)采用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织，观察到了细胞生长现象，开创了动物细胞培养先河。 1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。 1923年,卡雷尔在悬滴培养的基础上，设计了用卡氏瓶培养离体的动物组织 ，使组织培养进入一个迅速发展的阶段。 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。卡式瓶可以较好地保证无菌环境，为细胞提供生长空间。为动物细胞体外大量培养发挥了重要作用。 1951年，Earle等人开发了供动物细胞体外培养的培养基。 Gey(1951)首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。 Hayflick(1961)首建人二倍体细胞系25种。 （世界各国建立统一细胞贮存库。如ATCC美国标准细胞库,1985年成立了中国典型培养物保藏中心:1990年中科院建立了细胞库。） 1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。 1965年，哈里斯和沃特金斯证明了灭活的病毒在控制条件下可诱导细胞融合。 70年代至80年代，利用动物细胞培养获得蛋白等生物制品迅速发展，在医学中发挥巨大作用。 2. 大发展时期 细胞融合技术使得人们可以在细胞水平上进行生命组合。 美国耶路大学组装出一只黄、白、黑毛的杂毛鼠。 英国组装成功了绵羊和山羊的嵌合体——绵山羊。 1977年，英国采用胚胎技术成功培育出世界上首例试管婴儿； 2004年结婚，2006年自然分娩一男婴； 全球试管婴儿已超300万 2007年3月26日美国科学家培育出首只人兽羊，有15％的部分属于人类 （喀迈拉（Chimera），是古希腊神话中一个长着狮子头、羊身体、蛇尾巴的吐火怪物。） 二、动物细胞的特点 1.体外培养动物细胞类型 2.体外培养动物细胞的特点 3.动物细胞群体生长特性 1、体外培养动物细胞类型 贴壁依赖型（anchroage-dependent cell)：有机体的决大多数细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长。（体外条件下同样） 2.动物细胞离体培养的生长特点 贴附：贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点 接触抑制(contact inhibition) ：细胞由于接触而抑制运动的现象。是区分正常细胞和癌细胞的标志之一 密度抑制(density inhibition) ：培养液中营养减少，细胞密度增大，导致细胞分裂停止； 3、体外培养动物细胞的生长与增殖 单个细胞的生长过程（细胞周期） 整个细胞系的生长过程(细胞系的演化） 每代细胞的生长过程 原代培养：直接从机体取出细胞、组织、器官立即进行培养（制成细胞悬浮液）到再一次转接重新培养的一段时间。 传代培养：原代培养的细胞继续转接培养的过程。 细胞系 :经过成功传代培养的细胞。 有限细胞系（finite cell line）：细胞系生存有限，传到一定代数即停止生长； 无限细胞系（immortal cell line） ：能维持无限繁殖能力，可以连续传代的细胞系； 细胞株：从细胞培养物中，筛选出的具有特殊性质的或特异标记的单个细胞经克隆形成的细胞群体。 饱和密度：在特定条件下，培养容器内能达到的最高细胞数，当细胞达饱和密度后细胞群体停止繁殖。（个/平方厘米；个/立方厘米） 培养细胞不同时期特点 培养细胞生长曲线（单培养周期）  潜伏期：刚接种,呈悬液；促贴附物(纤粘连蛋白fibronectin等)作用下,细胞贴壁铺展,基本无分裂。 指数增生期(3-5天）：增殖旺盛阶段,活力最好,数量增多, 密度增大，发生接触抑制,运动停止； 平台期（停止期）：细胞量达饱合密度、不增殖,,进