AdRGD-INGPTEN对MEG01人白血病细胞的抑制作用.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（３）：９１７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ对ＭＥＧ０１人 白血病细胞的抑制作用 黄　晨　王家融　杨吉成　盛伟华　缪竞诚 （苏州大学医学部　苏州　２１５１２３） 摘要　目的：构建 ＲＧＤ修饰的ＩＮＧ４和 ＰＴＥＮ双基因共表达重组腺病毒载体（Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ ＰＴＥＮ），研究其对人白血病细胞ＭＥＧ０１的抑制作用。方法：采用ＡｄＥａｓｙＴＭ腺病毒重组系统，在 本科室已成功构建的ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶＩＮＧ４ｐｏｌｙＡｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶｐｏｌｙＡｐｒｏｍｏｔｅｒ腺病毒 转移质粒的基础上，在多克隆酶切位点的ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ间插入 ＰＴＥＮ片段，得到ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ ＩＮＧ４ｐｏｌｙＡｐｒｏｍｏｔｅｒＰＴＥＮ重组转移载体，与 ＲＧＤ４Ｃ修饰的腺病毒骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ１（ＲＧＤ） 同源重组后，经包装和扩增获得 ＩＮＧ４和 ＰＴＥＮ双基因共表达重组腺病毒Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ。 将Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ体外感染人白血病细胞ＭＥＧ０１，检测腺病毒对ＭＥＧ０１细胞的感染效率， Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测外源基因ＩＮＧ４和ＰＴＥＮ在ＭＥＧ０１细胞中的表达，ＣＣＫ８法检测外源基因的导 入对ＭＥＧ０１细胞的生长抑制作用，流式细胞仪检测外源基因导入对ＭＥＧ０１细胞的凋亡和周期的 影响。结果：鉴定结果显示，成功构建了Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ双基因共表达腺病毒，其能有效地 感染ＭＥＧ０１细胞。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到ＩＮＧ４和ＰＴＥＮ在ＭＥＧ０１细胞中的表达；ＩＮＧ４和ＰＴＥＮ基 因能明显抑制ＭＥＧ０１细胞的生长，诱导其凋亡并产生Ｇ２／Ｍ期阻滞作用，且双基因联合作用较单 基因作用更明显。结论：成功构建了ＲＧＤ４Ｃ修饰的ＩＮＧ４和 ＰＴＥＮ双基因共表达腺病毒载体 Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ。收获的腺病毒能有效感染人白血病ＭＥＧ０１细胞。Ａｄ．ＲＧＤＩＮＧ４ＰＴＥＮ具 有抑制ＭＥＧ０１细胞的生长、诱导其凋亡及Ｇ２／Ｍ期阻滞的作用。 关键词　腺病毒　ＩＮＧ４ＰＴＥＮ　白血病 中图分类号　Ｑ８１３ 　　生长抑制因子蛋白家族（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｇｒｏｗｔｈｆａｍｉｌｙ， 发挥特异性抗肿瘤效应，靶向诱导肿瘤细胞凋亡，是一 ＩＮＧ）包括 ＩＮＧ１，ＩＮＧ２，ＩＮＧ３，ＩＮＧ４和ＩＮＧ５，是一组重 种潜在的新型抑癌基因。 要的肿瘤抑制因子。ＩＮＧ４于２００２年从人的脑垂体中 　　ＰＴＥＮ基因是在１９９７年由３个不同的研究小组分 ［１］ ［２］ 别用不同的方法获得，分别命名为ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ 被分离出 ，２００３年由Ｓｈｉｓｅｋｉ等鉴定 。该基因跨度 为１３ｋｂ，定位于人类染色体 １２ｐ１３．３１。研究表明， ａｎｄｔｅｎｓｉｎｈｏｍｏｌｏｇｕｅｄｅｌｅｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｔｅｎ）、 ＩＮＧ４基因可以通过控制Ｐ５３乙酰化状态来调节Ｐ５３功 ＭＭＡＣ１（ｍｕｔａｔｅｄｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅａｄｖａｎｃｅｄｃａｎｃｅｒｓ１）和 ［３］ ＴＥＰ１（ＴＧＦｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｅｎｒｉｃｈｅｄ 能，使 Ｐ５３的转录活性增强，肿瘤的发生即被抑制 。 β ＩＮＧ４诱导的Ｐ２１的上调可以增强细胞周期调节蛋白 ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ），它是一种具有双特异磷酸酶活性的抑癌 ｃｙｃｌｉｎＢ１和Ｐ２１的结合，启动细胞 Ｇ２／Ｍ周期阻滞，最 基因，不仅有脂质磷酸酶活性，而且有蛋白磷酸酶活 ［４］ 性，定位于人类染色体 １０ｑ２３．３。ＰＴＥＮ主要通过抑制 终抑制细胞的增殖 ，由此可见，ＩＮＧ４可通过多途