刺参消化道内产琼胶酶菌株的选育与培养条件优化.pdfVIP

刺参消化道内产琼胶酶菌株的选育及培养条件优化 马悦欣，安军，刘双连，徐高蓉，于书渤 (大连水产学院 农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室，辽宁大连 1 16023) 摘 要：对刺参消化道内容物进行富集培养、以琼胶为唯一碳源的平板初筛、摇瓶复筛得到 一株琼胶酶活性较高的菌株 HF3 ，对其进行紫外线诱变，获得突变菌株 HF3-04 ， 酶活从 43.0U ／ml 增加到48.9U ／ml ，提高了 13.8% ，菌株HF3-04 具有较好的产酶稳定性。通过 正交试验确定其最佳培养基组成为琼胶3‰、硝酸铵1‰、磷酸氢二钠0.5mM 、pH 值8.0； 该菌株的最佳培养条件为接种量1%、装液量为250ml 三角瓶装入110ml 发酵培养基、摇床 转速 150r⁄ min 、培养温度25 ℃、培养时间48h 。经培养基组成及培养条件优化后，菌株酶活 力达80.7 U ／ml ，比优化前提高了65.0%。 关键词：刺参； 琼胶酶；紫外线诱变；培养条件优化 琼胶是一种亲水性的红藻多糖，琼胶酶能够水解琼胶多糖，因此琼胶酶在红藻的单细胞 分离、酶解破壁制备原生质体等过程中具有重要的价值，是海藻遗传工程的工具酶。琼胶降 解形成的低聚糖产物可作为功能性食品、药品的原料和添加剂，近年来发现其在日用化工领 域中也有新的用途[1]，同时琼胶酶在分子生物学方面也有很大的应用价值，可以利用琼胶 酶从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA[2] 。因此琼胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。 传统的酸降解方法制备琼胶低聚糖存在着条件难控制、产物不均一等问题[3 ] ，缺乏具有专 一高效降解能力的琼胶酶，阻碍了琼胶低聚糖的开发和应用。 利用海洋微生物的琼胶酶制备琼胶低分子量活性片段，已成为琼胶工业化研究的重要方 向。目前降解琼胶的海洋细菌主要是从海水、海藻和底泥等样品分离得到[4-10]，Erasums 等研究发现以海藻为食的鲍鱼消化道中也存能降解琼胶的细菌[11]。作者从海洋棘皮动物刺 参消化道中选育得到一株琼胶酶活力较高的突变菌株HF3-04，并对其培养条件进行了研究， 得出其最佳的产酶培养基组成及最佳培养条件，为琼胶酶的深入研究以及琼胶低聚糖的开发 应用奠定了基础。 1.材料与方法 1.1 培养基组成 1.1.1 富集培养基：琼胶 2g ，无机盐母液 1000ml，pH 7.2—7.6 无机盐母液：硫酸铵 5g，磷酸氢二钾 5g，硫酸镁 1g，磷酸铁 0.01g，蒸馏水 1000 ml 1.1.2 初筛培养基 （2216E ）：蛋白胨 5g，酵母膏 1g，磷酸铁 0.1g，琼胶 15g，陈海水 1000ml， pH 7.6 1.1.3 发酵产酶系列培养基： 液体种子培养基：琼胶 2g ，蛋白胨 10g，酵母膏 10g，磷酸氢二钾 1g，氯化铵 1g， 陈海水 1000ml，pH 7.6 -1- 发酵培养基：琼胶 2g ，磷酸氢二钾 1g，氯化铵 1g，陈海水 1000ml pH 7.6 1.2 菌株的筛选 1.2.1 富集培养 2005 年 4 月从大连拉树房海参养殖厂采集新鲜的刺参样品，快速带回实验室，无菌 操作取消化道内容物于 25ml 富集培养基的三角瓶（250ml ）中。28 ℃、150r⁄ min 震荡培养 3d 后，移取 5ml 培养液到另一盛有新鲜培养基的三角瓶中继续培养，重复同样操作 5 次， 进行初筛。 1.2.2 初筛 将富集培养的菌液用无菌海水适当稀释，涂布于初筛培养基平板上，28 ℃培养 48h ，将 形成较大透明圈或较深凹陷的菌落进行纯化，获得纯培养于 2216E 斜面保存。 1.2.3 复筛 将菌株于 2216E 斜面活化后接入液体种子培养基中，28 ℃、150 r⁄ min 培养 24h ，再接 入发酵培养基，28 ℃、150 r⁄ min 振荡培养 48h 。发酵液于 3500 r⁄ min 离心