抗hiv2gp36基因工程抗原单克隆抗体对的制备 鉴定和初步应用.docx

中文摘要细胞株分泌单抗的稳定性。杂交瘤细胞株细胞注入BALB／c 中文摘要 细胞株分泌单抗的稳定性。杂交瘤细胞株细胞注入BALB／c 小鼠腹腔，每只注射1×106个细胞，制备腹水，得腹水型单 抗；杂交瘤细胞株细胞置于完全培养液内培养，细胞长满后 取上清，得上清型单抗；杂交瘤细胞株细胞用无血清1640 液培养，待细胞充分生长后收集上清，得无血清型单抗，作 间接ELISA测定单抗的Ig类别。用间接ELISA法测定腹水 型单抗的效价，同样的方法测定其与gp36反应的特异性及 与HIV．1 p24、gp41和gpl20的交叉反应性。腹水型单抗(8E5 和8H9)做耐热性、耐冻融性实验及pH值对单抗稳定性影 响实验。耐热性实验分为56℃30min，37℃保存1．7d和．4℃ 保存7d。耐冻融性实验是腹水型单抗于．20℃冻存后室温自 然融化，反复冻融6次后测定效价。测定pH值对单抗稳定 性影响实验，是分别以O．05M pH2．2甘氨酸．盐酸缓冲液， O．01M pH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)和O．05M pH9．6碳酸盐 缓冲液将腹水型单抗(以正常鼠血清作阴性对照)作1：100 稀释，4℃静置24h、48h、72h后间接ELISA法测定其OD450 与阴性对照OD450的比值。采用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法 纯化腹水型单抗(8E5、12E3、8H9和5E9)：依次用50％、 33％、33％SAS沉淀后，4。C对PBS透析过夜，得SAS纯 化的单抗(SAS．McAb_)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE) 鉴定SAS．McAb的纯度；间接ELISA法测定SAS．McAb的 效价并比较其相对亲和力。用HRP标记SAS．McAb，并用 直接ELISA法测定标记后的单抗效价。用阴离子交换介质 DEAE．Sepharose CL．6B进一步纯化SAS．McAb(8E5和8H9) 得到的单抗为AEC．McAb。采用SDS．PAGE法鉴定 AEC．McAb的纯度；采用David-Beatv的方法绘制OD．Ab 中文摘要曲线，找出OD．50对应的抗体浓度，计算亲和力。以gp36 中文摘要 曲线，找出OD．50对应的抗体浓度，计算亲和力。以gp36 免疫新西兰白兔制备抗gp36的血清型多克隆抗体(多抗)。 以SAS沉淀法纯化血清型多抗中的IgG类抗体。用纯化的 抗gp36的单抗与单抗、单抗与多抗分别进行配对，建立单 抗．酶标单抗夹心EUSA法和单抗．酶标多抗夹心EUSA法： 检测不同稀释浓度的gp36，确定检测的敏感性；检测与 HIV-1 p24、gp41和gpl20的交叉反应性，确定检测的特异 性。 结果： 经细胞融合、地虹选择培养、抗体检测筛选、克隆化 培养得到九株稳定分泌抗gp36单抗的杂交瘤细胞株，分别 命名为8E5、12E3、8H9、4F9、5E9、5G6、11G4、1188和7氏。 细胞株稳定性较好，体外连续传30代、液氮中冻存3个月 后复苏测定，细胞株仍可稳定分泌单抗。 腹水型单抗中，．8E5、12E3、8直9和5E9的效价较高，前 两者达1：5120000，后两者达1：640000。除4F9分泌的单抗 的Ig类别为IgG2b外，其余均为IgGl。抗体特异性检测发 现：8E5、12E3、8H9、5E9、11G4和1188与gp36特异性结 合，不与HIV-1 p24、gp41和gpl20发生交叉反应；而4F9 与gpl20发生交叉反应，5G6、7氏‘与gp41发生交叉反应。 取杂交瘤细胞株8E5和8H9腹水，鉴定单抗的热稳定性 和耐冻融性及不同pH条件对单抗稳定性的影响。结果发现： ①8E5腹水，4℃放置7d，效价未降低；37℃放置7d后效价 降至1：2560000；反复冻融6次效价不变；56℃30min效价 降至1：1280000；②8H9腹水，4℃放置7d，效价降至 1：320000；37℃放置4d效价降至1：320000，放置6d，效价 中文摘要降至1：160000；反复冻融6次效价不变；56℃30min效价 中文摘要 降至1：160000；反复冻融6次效价不变；56℃30min效价 降至1：160000。pH值对8E5、8H9单抗稳定性影响的实验结 果显示，酸性和碱性都可使单抗稳定性下降，酸性条件影响 尤为严重。 HRP标记8E5、12E3、8H9和5E9单抗，直接ELISA法 测定标记后的单抗效价分别为1：640000、1：640000、1：160000 和1：160000。选用可以配对检测gp36抗原的8E5单抗和8H9 单抗建立单抗．酶标单抗夹心EUSA法，对基因重组gp36 的检测灵敏度为125ng／礼。 获得的抗gp36的血清型多抗，经50％、33％、33％SAS 沉淀后效价为1：5120000。HRP标记兔抗gp