常用生物信息学软件应用基础.ppt

中山大学中山医学院《生物信息学》 常用生物信息学软件 吕志跃 一、PCR 原理与应用 PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。 Which one(s) can be a “primer”? Primer Design Criteria Computer-Aided Primer Design 举例 1.只为鉴定转录水平：可用软件分析； 2.尚需下游研究：软件与人工共用 待扩增的目的片段 ATGGTCAATCGAGCAGAGGCTGCACAACTTCTAAAACATCTTGACAAAGATAACAGTGGGAAAATCAGCACACAAGAGCTAATGGAATTTTTGAGCAGCGTTAACTGCCCATTCAACAAAGCACAGGTTGAGAAGTTTATTAAAGTACATGACGCGGATGGAGATGGACAACTAAATACTGATGAACTTCTTAAAGTTTTGTGCCAATAA 1.只鉴定有无 2.尚需下游研究：全长或ORF ATGGTCAATCGAGCAGAGGCTGCACAACTTCTAAAACATCTTGACAAAGATAACAGTGGGAAAATCAGCACACAAGAGCTAATGGAATTTTTGAGCAGCGTTAACTGCCCATTCAACAAAGCACAGGTTGAGAAGTTTATTAAAGTACATGACGCGGATGGAGATGGACAACTAAATACTGATGAACTTCTTAAAGTTTTGTGCCAATAA 上游引物：5’GCCATATGATGGTCAATCGAGCAGA3’ 下游引物：5’ GCTCGAGTTATTGGCACAAAACTT 3’ 需要注意的地方： 1.克隆入载体中是否会引起移码； 2.目的片段内部是否含有引物中相同酶切位点； 3.如果不能满足“标准”，可改变个别碱基，前提是不能引起翻译的氨基酸残基发生变化 4.便于纯化 Real time PCR Primer design 1.下载所要比对的序列： Analyze online ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html “*”显示100%保守区域； “：”显示保守替换； “?” 显示非保守替换 方法 BLASTP * 常用生物信息学软件应用基础 * Importance of Primers in molecular biology - cloning- hybridization- sequencing- mutagenesis- detection- DNA fingerprinting- PCR Genome sequence Microarrays etc. 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ Uniqueness: ensure correct priming site Length: 17-28 bases.This range varies Base composition: average (G+C) content around 50-60%; avoid long (A+T) and (G+C) rich region if possible Optimize base pairing: it’s critical that the stability at 5’ end be high and the stability at 3’ end be relatively low to minimize false priming Melting Tms between 55-65 ?C are preferred Assure that the primer pairs have annealing Tm within 2 – 3 ?C of each other. Minimize internal secondary structure: hairpins and dimmers should be avoided. Primer design is an Art when done by human beings. The design is far better when done by machines.? Followings are some common primer