第三章 载体与宿主的选择.pptVIP

第三章 基因工程载体及宿主 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 50-400k 人工染色体 20-45k 粘粒载体 1.5k M13噬菌体载体 0-10k或10-25k λ噬菌体载体 0-3k 质粒载体 插入大小 6 真核细胞的克隆载体 6.1 酵母细胞中基因克隆常用载体 共同特点 （1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； （2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记； （3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体 1.整合型载体（YIP） 2.复制型载体（YRP） 3.附加体型载体（YEP） YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。 YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（Shuttle Vector）.穿梭载体在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失 YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2μm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2μm质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。 6.2 植物基因克隆的载体——Ti质粒 Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称Ti质粒。 T-DNA的染色体整合机制 农杆菌介导法 共整合转化程序 二元整合转化程序 6.3 动物细胞基因克隆的载体: SV40病毒载体 SV40病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。 受纳细胞（permissive cell）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒，并使寄主细胞裂解，如猿猴细胞 。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变，如小鼠或仓鼠的细胞 。 SV40病毒载体 1. 取代型重组病毒载体 2. 重组的病毒-质粒载体 取代型的重组病毒载体（recombinant Virus Vector）,其特点是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 重组的病毒-质粒载体 只取病毒基因组中维持在辅乳动物中进行复制的有关序列，使它与一个细菌质粒融合。 含有完整早期区段的复制起点的病毒-质粒载体（如Pac10）：它是由病毒的早期区段和复制点同大肠杆菌的质粒分子重组而成。由于既能在大肠杆菌中复制，又能在哺乳动物细胞中复制，所以也称为穿梭载体。 微型病毒复制子-质粒载体：只是把SV40复制起点片段插入到大肠杆菌质粒载体上，可用于特殊细胞系来克隆和表达比如前面讲的COS细胞 。 第二节 用于基因转移的受体菌或细胞 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体 受体细胞应具备的条件 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性 大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定