第23章-氧化应激损伤生物化学诊断.pptVIP

(二) ·OH检测 (三) H2O2的检测 (一) O2 的检测 · 一、主要活性氧的检测 * NBT还原法 高铁细胞色素C还原法 羟胺氧化法较为常用 1. 物理检测方法 (一) O2 的检测 · 电子自旋共振(ESR)波谱分析法——直接法 电子顺磁共振(EPR)波谱分析法——间接法 优点：操作均较简单 缺点：需昂贵的仪器，应用均受到限制 2. 化学检测方法——间接法 * 一种较灵敏检测O2的方法，其检测限量可达1μg/L。 · 具有设备简单，试剂便宜易购，操作简便，专一性好，结果较为准确等优点，适合于一般实验室的检测。 羟胺氧化法 O2 能与羟胺溶液反应生成NO2－，NO2－与对氨基苯磺酸和α-萘胺显色，在波长530nm处有专一吸收峰，其颜色深浅与产生的O2 呈量效关系。 · · 【方法学评价】 【注意事项】 严格控制反应系统pH＜8.0，尽可能降低反应中的溶解氧及铁含量，这样测出的O2 产生速率才更接近实际水平。 · * (二) ·OH检测 原理是无荧光的对苯二甲酸与·OH反应形成强荧光的羟-对苯二甲酸加成物，315nm激发，可发射425nm荧光，可检测受物理因素及化学因素处理后水溶液中产生的·OH。 自旋捕捉法 气相色谱法(GC) 高效液相色谱(HPLC) 优点：准确度较高 缺点：操作繁琐，仪器 昂贵，不便推广 优点：操作简便，测定快速，灵敏度 较高，稳定性较好。 缺点：特异性不太高，需化学发光仪 分光光度法 荧光分析法 ——方法简便，易为一般实验室采用 化学发光法 * 【原理】利用H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH，使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据反应前后A536下降值进行计算。 分光光度法 溴邻苯三酚红光度法 【原理】利用H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH与溴邻苯三酚红形成有560nm处吸收峰的有色化合物，根据反应前后A560的升高值进行计算。 邻二氮菲-Fe2+氧化法 细胞色素C氧化法 水杨酸比色法 这两种方法稳定性好、操作简便、测定快速。 * (三) H2O2的检测 碘滴定法 分光光度法 化学发光法 荧光法 通过测定CAT和过氧化物酶的活性 也可估测H2O2的水平 H2O2是最稳定的活性氧 检测方法: * 1. 分光光度法 过氧化物酶-氧化酶法 Fe2+-邻二氮菲分光光法 碘化钾比色法 * 碘化钾比色法 快速、简便、重复性好，适合于溶液中μmol/L水平的日常测定。 【原理】 H2O2+KI I2 钼酸铵 蓝色化合物 淀粉 【方法学评价】 * 过氧化物酶-氧化酶法 经典的比色法，整个反应过程约20min，是一种操作简便、灵敏度较高(可达10-9μmol/L水平)的方法。 【原理】 在弱酸性环境下，过氧化物酶-氧化酶反应中的NADH往往被完全消耗。 而在较高pH值环境下，NADH至少在反应的开始阶段并不完全被消耗，测定A340下降值, 计算NADH被消耗量。 【方法学评价】 * 2. NADPH氧化法 两方法灵敏度均较高。 前者无需制作H2O2的校正曲线，操作简便， 适用于大批量样品的同时测定。 后者适用于生物反应体系中微量H2O2测定。 【原理】测定体系中NADPH的氧化与H2O2的含量成正比 GSH-NADPH氧化法 Scopoletin-NADPH氧化法 【方法学评价】 * 二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定 (一) 一氧化氮(NO)测定 NO含量少，且极不稳定, 较难直接测定其含量。 常用测定NO含量的方法多利用NO的化学性质，测定其终末产物NO3－和(或)NO2－的含量来反映组织细胞NO的含量。 物理方法有微电极法和EPR法，优点是灵敏度较高，可实时检测，但需昂贵仪器限制了应用。 化学方法有Griess试剂法、硝酸盐还原酶法、荧光分光光度法、催化光度法、化学发光法，其中以Griess试剂法最为常用。 * 1. Griess试剂法： A550与NO2－或NO的产量成正比，据此测定 NO2－ +对氨基苯磺酸 重氮化合物 pH7.5～8.1 重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺 紫红色产物 偶联 550nm 本法稍加修改即可用于测定样品中的总硝酸盐含量(NO3－与NO2－浓度之和)。