定量聚合酶链反应测定技术1.pptVIP

定量聚合酶链反应测定技术及临床应用 定量PCR测定技术之　PCR概论 PCR最早的设想：1971年Korana提出核酸体外扩增的设想 1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（ PCR， Polymerase Chain Reaction） PCR的改进与完善：TaqDNA多聚酶的应用 1993年 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖 定量PCR测定技术之　PCR概论 PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成 定量PCR测定技术PCR概论 PCR的反应动力学： DNA扩增呈 指数上升， PCR扩增的理论模式 每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn=Yn-1·(1+E) 0＜E＜1 （1） 扩增产物的总数量可以下式表示： Yn=X·(1+E)n （2） PCR扩增的实际情况： 已知：扩增周期（n）、扩增总产物量（ Yn） 未知：起始模版数（ Y0） 变量：扩增效率（E） 影响扩增效率E的因素 ——定量PCR的困难 引物/靶核酸的退火情况 参与扩增反应试剂的相对量（Taq酶/靶核酸之比、 扩增仪孔中温度的不均一性、 临床标本中的Taq酶抑制物的去除不完全） 因此在扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量。 定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别 定量PCR测定技术方法 方法： 外标方法 动力学方法 内标共扩增方法 　　所有的定量PCR方法均围绕变量E展开 定量PCR测定技术方法 定量： 绝对定量（即测定X的分子数量） 相对定量（测定不同样本中X的 比率） 定量PCR测定技术外标方法 定量PCR测定技术外标方法 定量PCR测定技术外标方法 广义外标定量PCR技术分三种类型： （1）外参法+终产物分析 （2）外标法+过程监测 （3）外标法+过程监测+内对照 定量PCR测定技术外标方法 使用外标的定量PCR方法的优缺点 优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异； 缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。 因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR原理： 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ???? 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR （1）Ct： C代表Cycle，t代表threshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR （2） 荧光域值（threshold）的设定 threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 ? 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR （3）Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR （4）荧光染料 1）TaqMan荧光探针： 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR 2）SYBR荧光染料： 定量PCR测定技术实时荧光定量PCR 3）MolecularBeacons Beacons 定量PCR测定技术动力学方法 通过确定PCR扩增的某一阶段的效率E来计算起始模板数。 定量PCR测定技术动力学方法 如果取的样本不连续，则可使用下述将公式（2）重排后得到的更为通用的公式，用参数j（取样中间隔的周期数）替代n，Yj（在较高循环周期数取样的产物量）替代Yn，Yi-j（在较低循环周期数取样的产物量）替代X： E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j (3) 定量PCR测定技术动力学方法 一旦效率确定后，根据公式（4）可从测定的产物量和循环周期数计算得到X。公式（4）来源于公式（2）的重新排列： X＝Yn/(1＋E)n （4） 定量PCR测定技术动力学方法 另一种方式是，根据公式（2）的对数形式，以所测定的Yn值的对数对函数n绘图得到X值：