SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 (1).pptVIP

SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 【实验原理】 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 N, N’-甲叉 双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CH CH2ˉ CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH ( )n ( )n ( )m ( )m PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 【SDS基本原理】 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分将子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW = K - bm 【操作方法】 １、制胶玻板的清洗 用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的 去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。 【操作方法】 2、垂直板电泳槽 1）分离胶的制备 配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶，小心覆盖一层蒸馏水，37℃烘箱下聚合（约30 min）。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水。 3、凝胶的制备 2）浓缩胶的制备 配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝胶储备液0.8ml，10% 过硫酸铵25ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，37℃烘箱下聚合（约30 min）。 4、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400