第五章 分子生物学研究法.pptVIP

（3）黏粒载体 粘粒载体pJB8结构 黏粒载体： 是人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 黏粒载体组成: 质粒复制子+ 噬菌体COS连接位点＋抗性筛选基因＋多克隆位点 黏粒载体的特点： （1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部必需基因，因此不具有完整的溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）； （2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA文库的构建。 画上荷花和尚画，书临汉字翰林书 Sau3A I： GATC 2.间断回文结构（interrupted Palindrome） 例如DNA分子如具有某种限制性酶切位点，该酶就能对之剪切，产生特异片段；而不同的DNA分子由于序列不同，酶切产生的片段也就不同，由此就能获得该DNA分子的物理图谱。 人工接头(linker)连接 MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位点) 病毒载体 是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体（in vivo）或是细胞培养（in vitro）中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。 　　可供利用的病毒可分为逆转录病毒、慢病毒与腺病毒。 　　1.分为： 噬菌体载体、杆状病毒载体、动物病毒载体、植物病毒载体 　　2. 优点：转导效率高、复杂的装配过程由细胞完成、不同病毒载体具有不[1]同表达特点 　　3.根据病毒载体在主细胞中的存在情况分为瞬时表达病毒载体和稳定表达病毒载体 　　3-1瞬时表达病毒载体包括： 乳多空病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体 　　3-2稳定表达病毒载体包括：牛乳头瘤病毒载体和EB病毒载体、逆转录病毒载体、腺联病毒载体（AAV）载体 多克隆位点（multiple cloning site, MCS）， LacZ基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基团X与半乳糖以糖苷键结合成的无色化合物X-gal。用含有X-gal的培养基培养细菌时，在细菌的乳糖操纵子(Lac operon)诱导物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落变为蓝色；如果LacZ基因被外源DNA分子插入而遭到破坏，则不能生成相应的半乳糖苷酶，菌落为白色。通过观察菌落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。 原子粒电镜 cos（cohesive-end site) ，12 个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3‘ cos位点（cohensive-end site):当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。 　感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 、 　　CaCl2法： 　　操作：　 　　1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。 　　2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 　　3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 　　意义： 　　将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。 　感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 、 　　CaCl2法： 　　操作：　 　　1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。 　　2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信