第十五章分子生物学常用技术与其应用.pptVIP

基因工程与分子生物学常用技术 第一节 基因工程与基因重组 二、工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的制备 基因诊断常用技术方法 基因诊断的临床应用 1.对疾病的早期确诊； 2.确定疾病易感性及疾病的分期分型 遗传疾病 如PKU 判断个体疾病易感性 糖尿病,高血压. 感染性疾病 病毒性肝炎,爱滋病等. 肿瘤的诊断分型. 器官移植组织配型 第 三 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 三、重组技术与医学的关系 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) （三）外源DNA导入受体细胞 （四）重组体的筛选 1.遗传学方法 2.分子杂交法 3. 免疫学方法 (插入失活法) 抗药性标记选择 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定或标志基因筛选 菌落原位杂交 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 三、基因诊断和基因治疗 定义: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基本过程 分离、扩增待测的DNA片断 区分或鉴定DNA的异常 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）基因芯片 × (CCTGAGGAG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 (CCTGTGGAG) MstⅡ酶切位点(CCTGAGG) + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 复性 RNA DNA 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 一、核酸分子杂交技术 第二节 分子生物学常用技术及其应用 基因工程中的杂交应用: (1)菌落杂交 (2)Southern 杂交 (3)染色体定位 (4)基因诊断 (5)亲子鉴定 (6)检测病原体 （一）核酸探针的制备 探针 (probe) 一小段用同位素标记或非同位素标记的已知序列的核苷酸片段。 二、核酸分子杂交的基本方法 1.DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 2.RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 3.蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 （二）核酸分子杂交的基本方法 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ Southern印迹 放射自显影照片 4.原位杂交 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 * 第 十 五 章 1.基因诊断 2.探针 3.核酸分子杂交 4.基因治疗 1.请简述基因诊断在临床医学中的主要应用？