始旋链霉菌普那霉素生物合成相关基因的克隆功能和表达分析生物化工专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素类抗生素，由普那霉素I和普那霉素 II两类化合物组成。主要用于治疗由革兰氏阳性菌包括耐药菌引起的感染。抗生素的生物 合成由抗性基因、结构基因及调控基因共同协调表达而完成。链霉菌具有复杂的形态分化 与次级代谢，其代谢途径是由生物合成酶、一些特异的信号分子和调控蛋白所组成的网络 体系，但到目前为止，仅鉴定出17个和普那霉素生物合成相关的基因，所以探寻与普那 霉素生物合成相关的新基因有着巨大的空间。 根据此目的，利用大肠杆菌与链霉菌接合转移技术而展开了对基因功能研究的系列工 作。首先对课题组前期以-9普那霉素生物合成密切相关的新基因aj台k-like为探针从始旋链 霉菌F618基因组文库中筛选得到含有约8kb的DNA片段上的aj疗k-like全长基因spyI进 行基因中断实验研究。从研究结果推断该基因可能与普那霉素IA生物合成正相关，而与普 那霉素IIA生物合成负相关。 由于抗生素的生物合成基因大多是呈簇存在于染色体上，所以接着对筛选到的经测序 的8kb的DNA片段进行分析，获得了其上的另外4个可能与普那霉素生物合成相关基因， 分别命名为sprl、spr3、spr4、spr5，同时对其进行了基因中断研究。研究结果表明这4 个基因可能与普那霉素、普那霉素IA及普那霉素IIA均为正相关。 最后本文利用-9普那霉素生物合成正相关性的抗性基因p护及链霉菌强启动子 ermEp*，通过对其强表达进行了分子育种研究。经过初筛及普那霉素复筛后得到一株普那 霉素高产菌株P6．sP，其普那霉素、普那霉素IIA及普那霉素IA的产量分别达到335．49 mg／L、286．12 mg／L、49．37 mg／L；分别为出发菌株F618的2．29、2．56、1．41倍；并且经 传代5次试验表明具有较好的遗传稳定性。 关键词：始旋链霉菌；普那霉素；基因中断；接合转移；生物合成；抗性基因 Ⅱ 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 Abstract Abstract The antibiotic pristinamycin,produced by Streptomyces pristinaespiral，is a mixture of two types of macrocylic lactone peptolides：pristinamycin I(PI)and pristinamycin II(PII) and is particularly active against gram—positive bacteria including drug-resistant pathogens． There are three types gene：resistant gene，structural gene and regulatory gene，involved in the biosynthesis of antibiotic．Streptomyces undergo complex morphological differentiation and secondary metabolism．The intricate metabolism system is belived to be linked by a network composed of biosynthesis enzyme and common regulatory elements，including some specific signaling molecules and some different types of regulatory proteins．So far,only seventeen gens involved in resistant gene，the structural and regulatory gene of PI and PII，were identified in＆ pristinaespiralis．So the discovery of novel genes goveming secondary metabolism is of particularly practical inerest，because they can be expoited to improve th