嗜线虫致病杆菌txp40蛋白毒素的分离纯化及作用靶标的研究分析农业昆虫与害虫防治专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得洹j量壅些太堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 红／虱 签字日期：矽钟年∥月≥日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解涸j墼壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权遛j量盘些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 独?斌 导师签名： 签字日期：万仰年∥月刁日 签字日期：多叶驴年 以致多 月 、∥ 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 万方数据 lIIII lIIII IIIIIlilllll IIII IIII III Y2668689 摘要 Txp40蛋白是昆虫病原线虫共生菌一嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila) 产生的～种具有血腔注射杀虫活性的毒素，编码该毒素的txp40基因广泛存在于多种 昆虫病原线虫共生菌中，具有很强的保守性。为了明确该毒素的杀虫机理及其在共生 菌致病过程中所起的作用，探索其开发应用的潜力，本实验以X nematophila HB310 菌株为材料，首先通过盐析和非变性凝胶电泳native．PAGE方法以及原核表达的方法 获得此蛋白，然后通过免疫共沉淀的方法寻找其作用靶标。实验结果如下。 1．利用85％饱和硫酸铵盐析的方法获得x nematophila HB310菌液细胞内总蛋 白，然后通过制备型非变性电泳8％native方法从中分离纯化Txp40蛋白，回 收的蛋白样品进行SDS．PAGE分析，结果表明回收的蛋白为单一的约40 KDa蛋白条 带，将其注射5龄大蜡螟幼虫，致死迅速，虫体头胸部黑化。回收蛋白与Txp40抗体 进行点杂交检测，出现阳性反应。这些实验结果表明回收的蛋白为具有杀虫活性的 Txp40蛋白毒素。 2．为了得到大量的的Txp40蛋白，从X nematophila HB310中克隆Ttxp40基因， 构建了pET28a-txp40重组表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达 出42kD左右的蛋白，和预测的重组蛋白分子量一致。对目的蛋白进行Western bloting 鉴定，证实诱导表达的42kD蛋白YgTx#O蛋白，生物测定结果表明重组Txp40蛋白对 大蜡螟幼虫具有血腔注射活性。 3．为了解Txp40蛋白的杀虫机理，利用免疫共沉淀方法检狈tlTxp40蛋自在大蜡螟 幼虫体内的靶标互作蛋白，首现提取大蜡螟5龄幼虫的总蛋白，利用Pierce@ Co—Immunoprecipitation试剂盒与Txp40蛋白进行免疫共沉淀，将洗脱下来的特异性蛋 白通过SDS．．PAGE电泳进行检测，获得分子量分别在200 kDa、100 kDa、60 kDa、40 kDa、35 kDa处的5个蛋白条带，将这5个蛋白通过基质辅助激光解吸电离飞行时问质 谱(MALDI．TOF—MAS)进行鉴定，初步确定了其中两种蛋白分别是细胞色素P450和半 胱氨酸合成酶。 关键词：嗜线虫致病杆菌；Txp40蛋白；原核表达；受体蛋白；大蜡螟 万方数据 Purification Purification and action target of Txp40 protein toxin from Xenorhabdus Abstract Txp40 protein is kind of insecticidal toxin with hemocoel injecting activity which is found from the Xenorhabdus nematophila．The txp40 genes encoding this protein is widely exists in many species of symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes and shows very strong conservatism．The research objectives to reveal the insecticidal mechanism a