p2x7受体介导nlrp3炎症小体活化在大鼠脑出血后脑损伤中的作用及其机制研究外科学神经外科专业论文.docxVIP

硕士学位论文因此，我们提出假设：在脑出血后，P2X7R激活，并活化NOX2产生的超 硕士学位论文 因此，我们提出假设：在脑出血后，P2X7R激活，并活化NOX2产生的超 氧阴离子和iNOS产生的一氧化氮反应生成ONOO。，后者激活NLPR3炎症小体， 介导IL．1 p和IL．1 8的成熟和分泌，引起一系列炎症反应，从而加重脑损伤。 目的： 本研究通过建立胶原酶注射大鼠脑出血模型：1、检测不同时间点脑组织 中P2X7R、NLRP3、ASC及caspase．1的表达变化，并检测P2X7R的细胞定位； 2、在基因层面针对P2X7R予以干预，了解P2X7R／NLRP3炎症小体信号通路在 脑出血后脑损伤中的作用；3、在药物层面针对P2X7R予以干预，为进一步临床 研究提供理论基础；4、观察P2X7R对NOX2和iNOS及ON00表达的影响， 并通过干预剂清除ON00。，以观察P2X7R、NLRP3炎症小体及其组件的表达变 化，进一步阐明NLRP3炎症小体的激活机制。 研究方法： 1、实验设计与分组 (1)36只大鼠随机分为6组：假手术组，脑出血后6h、12h、24h、48h及72h 组。应用免疫印迹(Western blot)方法检测P2X7R、NLRP3、ASC及caspase-1 的表达情况，应用免疫荧光(immunofluorescenee)技术观察P2X7R的细胞定位情 况。 (2)88只大鼠随机分为4组：假手术组、生理盐水对照组、空白siRNA(control siRNA)对照组及P2X7R siRNA组。通过Westem blot和实时荧光定量PCR(real time PCR，RT．PCR)方法检测P2X7R siRNA的干扰效率，干湿重法测量脑组织水 含量变化及改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score，mNSS) 评估大鼠神经功能。 (3)132只大鼠随机分为4组：假手术组、生理盐水对照组、BBG(Blue Brilliant G)50mg／kg组及BBG lOOmg／kg组。采用干湿重法及苏木素伊红染色(Hematoxylin Eosin staining)测检测脑水肿变化，mNSS法评估大鼠神经功能，TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)检测神经元凋亡， III 万方数据 摘要Western 摘要 Western Blot及RT．PCR检测相应的蛋白分子变化，工F检测中性粒细胞浸润及 NOX2和iNOS及ONOO‘表达情况。 (4)33只大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水对照组和FeTPPS组。Westem Blot检测相应的蛋白分子变化。 2、脑出血模型制作 成年雄性SD大鼠，体重为280．3209，在立体定向仪辅助下，向大鼠右侧尾 状核注射胶原酶．VII(19l，0．25 U)，制成大鼠脑出血模型。假手术组大鼠以同 样的方法在相同位置仅做单纯穿刺。 3、RT．PCR方法检测mRNA表达水平 大鼠深度麻醉，断头取脑。取患侧损伤脑组织约40mg，负80。C冰箱保存备 用。采用GeneJETTM RNA Purification Kit试剂盒按说明书步骤提取RNA。逆转录 后采用ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪进行实时PCR。 4、Western Blot检测蛋白表达变化 大鼠深度麻醉，断头取脑，取患侧损伤脑组织约100mg，．80。C冰箱中保存 备用。组织标本经匀浆、裂解、离心后，采用Bradford法蛋白定量。蛋白裂解 液依次经过电泳、转膜、孵育一抗及二抗、显影及定影。凝胶成像系统扫描并 分析目的蛋白表达变化。 5、组织石蜡切片的制作 大鼠麻醉后，先后用生理盐水和4％多聚甲醛心脏灌注。冠状切面切取损伤 处脑组织，置于4％多聚甲醛，4。C条件下固定24dx时。组织脱水、透明后，制作 成石蜡切片，切片厚度39m。捞片、风干、烤片后置于负20。C冰箱备用。 6、组织学染色及血肿体积计算 切取损伤处脑组织(厚度lmm)包埋、切片后进行苏木素伊红染色。Image ProPlus6．0软件计算血肿体积。 7、免疫荧光染色 石蜡切片脱蜡至水，在Tris—EDTA(PH 8．5)或柠檬酸盐中给予微波热修复 21分钟；血清封闭后滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS溶液冲洗后滴加相应荧光二 IV 万方数据 硕士学位论文 硕士学位论文 抗，室温下孵育1h。对于荧光双标，一抗分别依次在4。C孵育过夜；显微镜下 观察、拍照并分析。 8、TUNEL染色 按说明书步骤进行原位凋亡检测试剂盒进行TUNEL染色，对于TUNEL与 NeuN共染者，先通过免疫荧光法进行NeuN染色，再