2012-11-7 质粒提取和限制性内切酶消化.pptVIP

质粒提取和限制性内切酶消化 目 的 巩固质粒的概念，通过原理部分的学习加深对质粒DNA与染色体DNA理化性质差异的认识 学习碱裂解法提取质粒DNA的方法 掌握酶切反应的操作 质 粒 提 取 质粒是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 是进行DNA重组的常用载体。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型主要为抗生素抗性。 质 粒 　　　　Ampr抗性基因 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 常 用 质 粒 提 取 方 法 煮沸法 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。提取的质粒DNA中会含有RNA。 碱裂解法 碱裂解法提取原理 宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异 加入碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开 当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 ①收菌 ②重悬 ③裂解 ④中和 ⑤过柱 ⑥洗涤 ⑦洗脱 质粒提取试剂盒操作步骤 P1: 50?mM葡萄糖?，25?mM?Tris-HCl, 10?mM EDTA pH?8.0 P2: 0.2?M?NaOH,1%?SDS P3: 3?M?醋酸钾, 2?M?醋酸 硅基质膜在高盐低pH值（pH≤7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱。 75%乙醇 对数生长后期 取菌液 12,000rpm离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清） 用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮 加入250uLP2，温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮) 加入350uLN3, 立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀） 12,000rpm离心10min 小心吸取上清，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液 加入700uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液 空柱12,000rpm 离心2min， 室温开盖放置3 – 5 min 加入500uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液 吸附柱置于新离心管中，加入50-100uLbuffer EB, 室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，-20 ℃保存。 CWBIO 取菌液 12,000rpm离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清） 用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮 加入250uLP2，温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮) 加入350uLP3, 立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀） 12,000rpm离心10min 小心吸取裂解上清，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液 加入500uL buffer PD 12,000rpm 离心1min， 弃滤液 空柱12,000rpm 离心2min， 室温开盖放置3 – 5 min 加入600uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液 （重复一次） 吸附柱置于新离心管中，加入50-100uL洗脱液 EB, 室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，-20 ℃保存。 TG （500uL 平衡液BL，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液） 质粒电泳图 开环的双链环状DNA 直线DNA 共价闭环超螺旋DNA