病毒纯化和检测-改.pptVIP

* 第一节 病毒的纯化 一、病毒纯化前的准备工作 繁殖病毒 利用生物学方法纯化病毒 病毒感染的纯化与诊断 二、标本的采取与送检 应注意下列原则： 1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后各取血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。 三、病毒和病毒成份的提纯 病毒纯度的判定依据： 物理均一性； 病毒滴度与蛋白含量的比例； 免疫反应单一而无非特异反应； 结晶形成 在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释放出来； 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方法； 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。 病毒提纯的主要原则： 四、病毒萃取液的分级纯化 沉淀法 中性盐沉淀法 聚乙二醇沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 离 心 法 差速离心法 密度梯度离心法 速率区带离心法 等密度区带法 凝胶色谱法 电泳法 病毒的感染单位（IU）：能够引起宿主或宿主细胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量； 病毒效价：指单位体积(ml)病毒悬液的感染单位数目(IU／ml)或称毒力 ； 噬菌体效价（pfu) ：又称噬菌斑形成单位数指单位体积的噬菌体，能使感染细菌裂解，产生噬菌斑的数量。 因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过100％，所以根据噬菌斑或空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌体电镜下观察数低。 一、侵染力的测定 第二节 病毒的检测 半致死剂量(LD50) ： 使半数宿主细胞死亡的病毒剂量称半致死剂量； 半致感染剂量(ID50) ：使半数宿主细胞发生感染的病毒剂量 ； 半数组织培养感染剂量(TCID50) ：使半数组织培养物发生感染，产生细胞病变效应的病毒剂量。 二、病毒的培养 1.动物接种 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。 2.鸡胚培养 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。 3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。 细胞的变化 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。 病毒在培养细胞中增殖的指标 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd) 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。 3.干扰现象(interference) 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。 4.细胞代谢的改变 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。 (二) 病毒的数量与感染性测定 1.蚀斑测定 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。 2.50%组织细胞感染量 (TCID50)测定法 该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间