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一． 一． 些查奎堂堡主兰垡堡奎 一一—— CATALOGUE 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 万方数据 山东大学博士学位论文胞内形式OPN通过稳定TRAF3正向调节抗病毒免疫反应 山东大学博士学位论文 胞内形式OPN通过稳定TRAF3正向调节抗病毒免疫反应 博士生：赵凯 导师： 高成江教授 专业： 免疫学 中文摘要 固有免疫系统作为机体抵御外界病原体入侵的首道防线，不仅可以激活适应性免疫系统，同时 也可以直接对入侵的病原体产生强烈的免疫应答，从而杀伤病原体。在病毒入侵时，固有免疫 系统可以激活产生多种细胞因子，其中最主要的是I型干扰素(IFN a／p)。固有免疫系统中 的多种的模式识别受体(PRRs)都与I型干扰素的产生相关，包括诸如Toll样受体(TLRs)， RIG—I样受体(RLRs)和内源性DNA感受器等。产生的I型干扰素可以进而与其受体结合，活 化JAK(Janus kinase)和STAT(Signaltransducers and activators of transcription)信 号通路，进而诱导IFN-stimulated genes(ISGs)的表达，最终清除病毒。 骨桥蛋白(osteopontin，OPN)又称为早期T淋巴细胞活化因子l(early T lymphocyte activation 1，Etal)，是一种分泌性的多功能糖蛋白。OPN可以调节多种生物体进程，包括细 胞分化、粘附、骨重构、恶性肿瘤和免疫反应。长期以来，OPN被认为是一个与炎症过程有关 的潜在的促炎症细胞因子，具有促进巨噬细胞分泌IFN一丫和IL—12的作用。近年来，随着胞内 形式OPN(iOPN)的发现，OPN在不同免疫细胞以及免疫反应的不同阶段中的不同调控作用逐 渐引起人们的重视。而iOPN在固有免疫系统当中尤其是抗病毒免疫当中的作用还未明确。 研究目的： 探讨OPN，尤其是iOPN是否可以调节病毒诱导的I型干扰素产生。如若可以调节I型干扰素产 万方数据 山东大学博士学位论文生，阐述其潜在机制。 山东大学博士学位论文 生，阐述其潜在机制。 研究方法： 1．首先检测不同病毒及刺激剂对OPN表达的影响。再利用OPN缺陷型(跏J于)小鼠与野生型 (WT)小鼠的腹腔巨噬细胞，经病毒刺激后，检测IFN B以及下游多种代表性ISGs的mRNA 水平变化、蛋白分泌水平变化等。通过构建全长型OPN(full length OPN)及胞内形式OPN (iOPN)表达质粒并转染进HEK293细胞，利用双荧光素酶报告基因，检测两种不同形式OPN 对于调节RNA病毒SeV所活化的IFN表达的影响，并检测iOPN质粒对于各种接头分子所活 化的IFN启动子区活性的调节作用。 2．利用OPN缺陷型(Sppl一‘)小鼠与野生型(WT)小鼠，通过腹腔注射VSV病毒，检测VSV 病毒在小鼠脏器中的滴度与含量，反应两类小鼠对于VSV病毒的抵抗能力的区别。 3．通过利用OPN缺陷型(Sppl。)小鼠与野生型(WT)小鼠腹腔巨噬细胞，以及iOPN过表达 质粒转染HEK293细胞，检测经sev刺激后，重要的IFN转录因子IRF3的活化水平变化。 4．经实时荧光定量PCR(q-PCR)以及双荧光素酶报告基因实验，检测iOPN质粒的靶点分子， 并经免疫共沉淀(CO—IP)以及免疫荧光等实验检测iOPN与靶点分子的结合情况。 5．明确靶点分子后，利用不同类型的泛素分子质粒，共转染iOPN及靶点分子进HEK293细胞， 检测其是否发生泛素化水平的变化，以及靶点分子的稳定性是否发生变化。 6．靶点分子若发生K48位泛素化水平的变化以及其稳定性若发生变化，说明iOPN可能可以调 节靶点分子的稳定性。通过对靶点己知的泛素化酶以及去泛素化酶进行筛选，寻找可能的 作用机制，并通过细胞水平以及体外翻译系统对结论进行实验性确认。 7．通过利用细胞过表达载体以及慢病毒表达载体构建iOPN—WT、iOPN-N、iOPN-C重组过表达 载体，通过体外翻译系统实验或对OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬细胞进行iOPN回补实验，明确 iOPN具体发生功能的区域。 研究结果： 1．首先，在利用RNA病毒VSV(水泡性口炎病毒)、SeV(仙台病毒)以及DNA病毒HSV(单纯 疱疹病毒)等病毒刺激野生型小鼠腹腔巨噬细胞不同时间点后，发现OPN的表达都有逐渐 升高的趋势；其次，在OPN缺陷型小鼠以及野生型小鼠巨噬细胞中加入SeV或VSV刺激不 2 万方数据 山东大学博士学位论文同时间后，发现相比较于野生型组，OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN 山东大学博士学位论文 同时间后，发现相比较于野生型组，OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN D的能力都明显 降低；将构建成功的全长型OPN表达载