0324细菌转化实验.ppt

;一、实验目的;二、实验原理;三、实验菌株;四、实验用具和药品;LB培养基配方：;实验药品;五、实验步骤;（二）菌体收集 实验当天 ： 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min； 弃上清;（三）碱裂解法提取质粒DNA 全套操作约需1小时，详细说明如下。 3. 加入250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过5分钟。 5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。 6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的Spin Column（离心柱）安置于Collection Tube （收集管）上。 8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。;9. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 将700 μl的Rinse（冲洗） B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。 注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率 14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 ;六、实验作业;实验二 大肠杆菌的遗传转化;一、实验目的;二、实验原理;三、实验材料;四、实验用品; 0.1M CaCl2溶液配制： 称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。 质粒的提取： 利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。 ;五、实验步骤; 3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养2~3h，每隔0.5h测OD600值； 4、当OD600=0.3~0.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置10~60min； 5、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清； 6、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞； 7、冰上放置15min； 8、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清； 9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞； 10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70℃保存。;（二）转化（冰上操作） 1、1.5mL管中加入感受态细胞50μL和待转化的质粒2μL，冰浴30min； 2、42℃热击90sec（勿晃动管子）； 3、冰浴2min； 4、加入37℃预热的LB至1mL； 5、37℃，振荡（50r/min）培养2h； 6、取200μL涂板（Ampr），37℃培养12-16h； 7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。;六、实验作业;准备工作