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总体原则
先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片段越短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
?引物设计原则
序列选取应在基因的保守区段
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构?
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高),GC含量在40%-60%
引物之间的TM相差避免超过2℃
引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp?
引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
?探针设计原则
探针位置尽可能地靠近上游引物
探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性
检测探针的DNA折叠和二级结构
Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%
探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
?Taqman MGB 探针设计
探针的5’端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
Tm值应为65-67℃。?
尽量缩短Taqman MGB探针,但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。?
原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。因此,在进行SNP检测时,为了检测到突变子,即Taqman MGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意:为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可向3’端移动,但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行SNP检测。反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变,突变位点也应靠近探针的5’端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。?
第三步:寻找一家信赖的公司合成引物和探针,一般引物合成大家比较熟悉,而且价格也比较便宜(特别是这两年便宜了许多),而探针则相对来说贵了许多,一般Taqman探针合成在1000到5000元不等(不同的合成要求价钱不同)——而这只是标记价钱,序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步:一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少,只是要加入Taqman探针,另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是:
扩增酶最好选用热启动酶
引物和探针的浓度需要进行优化,有人建议从50nM开始,在50nM—900nM之间优化,一般为200nM(注意探针需要避光保存。
同样Mg+和酶量也需要进行优化,酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U(50ul)
DNA模板的添加量通常在100 ng以下,因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应,第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针
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