从t细胞角度探讨广藿香酮对炎症性肠病的免疫调节作用中药学专业论文.docxVIP

广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明： 广州中医药大学学位论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结 果由本人承担。 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授 权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名蝣论文导师签名 日期： 年 月 曰 中文摘要研究目的 中文摘要 研究目的 炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因未明的慢性肠道免 疫性疾病。一般认为IBD的发生是环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群的 参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致自身免疫性炎症反应。其中， IBD的自身免疫性特点与T细胞免疫应答密切相关，特别是肠道粘膜上Th细胞 亚群失衡。因此，从调节T细胞亚群失衡角度，尤其是Th细胞亚群，深入了解 IBD多因素多靶点的发病机制，对进一步阐明IBD的免疫发生机制有重要意义。 广藿香是治疗暑湿蕴结诱发的胃肠疾患的岭南道地药材，具芳香化浊、开胃 止呕、发表解暑的功效。广藿香酮(Pogostone，PO)是广藿香的主要有效成分。 本课题组前期研究证实，广藿香的挥发油成分可明显缓解三硝基苯磺酸 (2，4，6．Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导的IBD症状。因此，本论文拟从 调节T细胞亚群平衡角度，观察广藿香酮对IBD的治疗作用，并对其作用机制 进行初步探讨，不仅有助于进一步认识IBD的免疫发生机制，更为科学阐释广 藿香药效物质基础的科学内涵提供依据。 方法 1．广藿香酮对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD的治疗作用 1)取雄性SD大鼠，设正常组(Normal)，模型组(Model)，柳氮磺吡啶组 (SASP，200mg／Kg)，广藿香酮组(PO，20，40，80meffKg)。除Normal组外，其 余各组通过直肠灌注TNBS(25mg／Kg)$【J备IBD模型。从造模当天开始，各组动 物连续7天灌肠给予相应药物，正常组及模型组给予等体积药物溶剂； 2)以体重变化、粪便性状、血便／便血情况建立疾病活动指数(Disease Activity Index，DAI)评分体系，评价动物。于实验第8天，剖取各组大鼠肛门至 盲肠段结肠，对大鼠结肠组织炎症作大体评分(Macroscopic score，MS)。结合DAI 和MS评分结果，在PO实验组中选择效果最优剂量组的样品进行以下实验： 3)所得结肠的病变部位(距肛门端约8cm)，部分通过苏木素／伊红 (hematoxylin．Eosin，HE)染色法，进行病理组织学评分(histological score，HS)， 同时通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)检测，分析CD4、叉头框蛋 白P3(Foxp3)、IFN小IL．17表达情况。此外，部分组织用于检测组织中髓过氧 化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性变化；应用酶联免疫吸附法(enzyme．1inked immunosorbent assay，ELISA)检测组织中转化生长因子．]3(TGF．B)含量，同时应 用液态悬浮芯片技术检测组织中白介素．17A(IL．17A)，IL．10，IL．4，IL．12p70， Y一干扰素{IFN．y)含量； 4)应用流式细胞术检测大鼠肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN) 中辅助性T细胞(helper 中辅助性T细胞(helper T cell，Th)中IFN吖、IL一4、IL．17和Foxp3表达率，分析 Thl、Th2、Thl7，以及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)LL例；同时检测其 中的Ki67、CD38／MHC II表达率，以分析MLN中Th细胞的增殖和激活状态； 5)应用荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative Realtime Polymerase Chain Reaction，quantitative rt．PCR)，分析结肠组织和MLN中转录因子(Transcript fator，TF)T-bet，STATl、GATA3、STAT6、STAT3、RORyt