代谢工程改造的链霉菌生物合成去甲基c1027和isomigrastatin的研究生物化工专业论文.docxVIP

浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 摘要 摘 要 本文对两种代谢工程改造的链霉菌生产两种重要的次级代谢产物进行了系 统的研究。 C．1027是Streptomyces globisporus产生的一种新型的大分子蛋白类抗肿瘤化 合物，属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。采用遗传操作技术使C．1027产生菌S ∥D6卸D，．螂中的sgcD4基因失活得至：lJsgcD4基因阻断的突变株SBl052，可以生产新 型C．1027衍生物——去甲基C．1027；而C．1027的生产可以通过sgcD4基因额外补 全恢复。这些结果不但进一步确认TsgcD4基因确实编码一个D-甲基转移酶，而 且明确突出了通过合理性设计发展结构复杂的天然产物(如烯二炔类化合物)结 构多样性的优势。然后通过系统的优化设计来提高去甲基C．1027这种新型抗生素 的发酵产量。首先建立了方便易行的生物检测去甲基C．1027的方法；经过优化， 最终得到了一个去甲基C．1027发酵生产的优良配方，去甲基C．1027的产量在摇瓶 发酵和1 0L发酵罐上批次发酵达至U95mg／L左右，提高到优化前的7倍，并达到了 野生菌产C．1027(50～100 mg／L)的水平。以上研究说明，将现代组合生物合成的 方法和传统的发酵优化相结合、以提高工程菌中新型代谢物的效价是一个非常有 效的策略。这为扩大天然产物库以便于新药发展提供了一个新的有效手段。 iso—Migrastatin(／so·MGS)是Streptomyces platensis NRRL 1 8993生产的一 种戊二酰亚胺类抗生素，是一种非常优良的抑制肿瘤转移的化合物。iso．MGS的 生物合成基因簇已经被成功克隆，并且／so．MGS已经在5种链霉菌宿主中成功得 到异源生物合成。然而，相对于野生菌，iso．MGS的异源生物合成产量非常低。 本文对五个异源工程菌的／so．MGS发酵生产进行全面系统研究。首先对五个异源 工程菌在三种培养基中的发酵进行对比分析，结果显示，工程菌SBll001和 SBl 1002更适合支持／so．MGS的发酵生产，R2YE发酵培养基适合支持／so．MGS的 发酵生产。然后对培养条件进行优化，结果为种子培养基选用R2YE培养基，培 养时间72h，接种量8％(v／v)，发酵培养收获时间为5天，发酵液初始pH值6．5。 在此基础之上，进行发酵培养基成分的优化，所有五个异源工程菌的生产效价得 到了大大提高，分别提高了3～18倍，SBl 1001最高产量达128．6mg／L。设计了两 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 摘要 种R2YE与B2的混合培养基，来同时达Niso．MGS高产和产物单一的目的，通过 探索，SBll001的iso．MGS发酵产量达到186．7mg／L。此外，为了验证碳酸氢盐和 iso．MGS发酵生产效价之间的的关系，在培养基中添加不同浓度的碳酸氢钠，结 果当NaHC03添加浓度为2 g／L时，iso-MGS发酵产量提高到]213．8mg／L。 利用实时定量RT．PCR技术的优势，将其应用于检测异源工程菌＆albus SBll001的iso．MGS的11个生物合成基因(mgsA—mgsK)的mRNA在四种不同培 养基下转录水平的差异。建立了一套行之有效的链霉菌实时定量RT-PCR实验流 程；首次对比了基因转录水平与iso．MGS生产之间的联系，结论是整个基因簇的 同步转录、而不是个别基因大量转录对iso．MGS的生产更重要，而且基因在72h 的转录量对于iso．MGS的最终产量非常重要。这些结果揭示了异源合成对 iso．MGS生产的发展潜力以及iso．MGS的生物合成机制，并为iso．MGS的大规模生 产和进一步临床发展奠定了基础。 关键词：去甲基C·1027，组合生物合成，代谢路径调控，iso—Migrastatin，异源 合成，定量RT-PCR，发酵优化 浙江大学博士学位论文