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温州医学院硕士学位论文钙离子对骨髓基质干细胞增殖及成骨分化的影响 温州医学院硕士学位论文 钙离子对骨髓基质干细胞增殖及成骨分化的影响 中文摘要 第一部分兔骨髓基质干细胞的体外培养及鉴定 目的 体外分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并进行鉴定，为组织工程提供 适宜的种子细胞。 方法 采用全血贴壁培养法获取原代兔BMSCs，观察细胞形态特征、生长状况。 间接免疫荧光法检测细胞表面CD34、CD44、CD45和CD90抗原的表达，并在培养 液中添加成骨诱导成分10。8M地塞米松、5mM B一甘油磷酸钠和50 H g／mL维生素C， 通过ALP染色、Von Kossa染色和茜素红染色鉴定BMSCs的成骨分化能力。 结果 采用全血贴壁培养法能够成功培养原代BMSCs，镜下见贴壁后细胞大体 呈细长形或多角形，传代后呈长梭形或纺锤形为主，经成骨诱导后的BMSCs较成 骨诱导前略显方形，体积短小一些。细胞免疫荧光染色CD44和CD90阳性，CD34 和CD45阴性，细胞表面标志表达与干细胞的特征一致。细胞经成骨诱导后行ALP 染色、Von Kossa染色和茜素红染色，结果均阳性，证实了本实验中BMSCs具有 成骨分化的潜能。 结论 采用全血贴壁培养法可以获取原代BMSCs，通过添加地塞米松、B一甘油 磷酸钠、维生素C能够成功地诱导BMSCs向成骨细胞方向分化。 关键词 骨髓基质干细胞；培养；成骨 第二部分钙离子对骨髓基质干细胞增殖的影响 目的 探讨源于柠檬酸钙的不同浓度钙离子对单层培养的BMSCs增殖的影响。 方法 取一定量柠檬酸钙粉末加入无钙培养基中配制成柠檬酸钙饱和溶液(含 钙离子约5mmol／L)备用，实验中稀释成不同浓度(1，2，3，4mmol／L)钙离子的 培养液，不加钙的为对照组(Ommol／L)。分别在含钙培养基中培养1，4，7和10 天后，绘制在不同浓度钙离子组BMSCs的生长曲线图，通过MTT法检测钙离子对 BMSCs增殖的影响。 结果 细胞生长曲线图显示各组的细胞数目随着时间的变化呈线性增多，第7 温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 天时到达峰值，而后细胞数目稍减少。在第4，7和10天时，3，4和5mmol／L组 的细胞数明显多于对照组，甚至lmmol／L组(PO．01或PO．05)。 结论 适度提高细胞外钙离子浓度能够促进BMSCs的增殖。 关键词 骨髓基质干细胞；钙；增殖 第三部分钙离子对骨髓基质干细胞成骨分化的影响 目的 探讨源于柠檬酸钙的不同浓度钙离子对单层培养的BMSCs成骨分化过程 的影响。 方法 取第三代BblSCs进行成骨诱导分化，予不同浓度钙离子(0，1，2，3，4，5 mmol／L)处理，进行ALP染色、Von Kossa染色、茜素红染色和ALP活性检测， 并在处理后的第7和14天采用RT-PCR法检测相关基因的表达，包括早期成骨分 化的ALP和I型胶原(COLL I)，晚期的骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(oCN)。 结果 随着钙离子浓度的增加，ALP染色后的颜色逐渐变浅，而Von Kossa染 色和茜素红染色后的颜色逐渐加深。ALP活性检测发现4和5mmol／L组的ALP活 性明显低于对照组(PO．05)。RT—PCR测定结果提示，在第7天和14天时， 3-5mmol／L组的ALP表达量明显低于对照组(P0．01)；COLL I表达量在第14天 时各组无明显差异，但在第7天时4和5mmol／L组抑制了胶原合成(PO．01)； OCN及OPN表达量随着钙离子浓度的升高而增多(PO．05或PO．01)。 结论 适度提高钙离子抑制了BMSCs的早期成骨分化，但能够促进后期细胞的 成熟矿化，有利于骨的形成。因此，在适度高钙条件下，BMSCs可以更有效地成 骨分化，从而使BMSCs更好地应用于骨组织工程。 关键词 骨髓基质干细胞；钙；分化；组织工程 温州医学院硕士学位论文Effects 温州医学院硕士学位论文 Effects of calcium on proliferation and osteogenic di仟erentiation of bone marrow stromaI cells in vitro Abstract Part 0Re Culture and identification of rabbit bone marrow stromal stem ce¨s ln VItrO Objective To supply seed cells for bone tissue engineering，bone marrow stroma cells(BMSCs)were isolated from rabbits，cultured and identi