多不饱和脂肪酸ara和epa合成途径在酿酒酵母中的重构生物学;微生物学专业论文.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 多不饱脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对所有生物正常发育和 代谢是非常重要的，是维持人体健康所必需的。虽然人体能够通过前体分子(亚 油酸和a．亚麻酸)进行多不饱和脂肪酸的生物合成，但是在某些情况下体内 PUFAs的生物合成量不足以满足机体的需要，因此必须通过饮食摄入PUFAs 才能维持自身机体稳定。通常情况下PUFAs主要来源于海洋鱼类和藻类，但是 由于过度捕捞，海洋污染以及藻类生产PUFAs价格的昂贵，因此寻找一种可替 代的多不饱和脂肪酸来源成了当务之急。 近年来，随着转基因技术的开展，利用转基因作物生产多不饱和脂肪酸成 为研究热点。在生物体中，多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯 酸(EPA)的合成主要是通过两种途径进行的：A6脱氢途径和△8脱氢途径。 本实验通过对ARA和EPA在酿酒酵母中的两条合成途径进行研究，以期望获 得一条更利于多不饱和脂肪酸ARA和EPA的合成途径，为转基因作物生产 ARA和EPA提供实验依据。 本研究首先根据已经报道的△5脂肪酸脱氢酶基因序列设计引物，从三角 褐指藻的eDNA上克隆获得△5脂肪酸脱氢酶基因，命名为ptd5。将重组质粒 pYPTD5转化酿酒酵母INVScl获得转基因工程菌株YPTD5。在添加诱导剂半 乳糖和外源底物DGLA和∞3．ARA的情况下，进行诱导表达。转基因工程菌株 YPTD5总脂肪酸甲酯GC分析表明，该基因编码的A5脂肪酸脱氢酶可以将 DGLA和03．ARA分别转化成ARA和EPA，转化率分别为28％和37％。 为在酿酒酵母中重构△6脱氢途径，将表达载体pYMAELO和表达载体 pYPTD5的△6延长酶转录单元和△5脱氢酶转录单元克隆到含有△6脱氢酶转 录单元的表达载体pYMl6上，构建成酿酒酵母表达载体pYMM5。将重组质粒 pYMM5转入到酿酒酵母INVScl中，获得转基因工程菌株YMM5。在添加诱 导剂半乳糖和外源底物LA和ALA的情况下，进行诱导表达。转基因工程菌株 YMM5总脂肪酸甲酯GC分析表明，三个基因均得到了表达，并且将底物LA 和ALA转化为终产物ARA和EPA，转化率分别为5．5％和8．3％。 摘要为在酿酒酵母中重构△8脱氢途径，将表达载体pYEFD和表达载体pYPTD5 摘要 为在酿酒酵母中重构△8脱氢途径，将表达载体pYEFD和表达载体pYPTD5 的△8脂肪酸脱氢酶和△5脂肪酸脱氢酶克隆到表达载体pYASE上，获得酿酒 酵母表达载体pYAE5。将重组质粒pYAE5转入到酿酒酵母INVScl中，获得基 因工程菌株YAE5。在添加诱导剂半乳糖和外源底物LA和ALA的情况下，进 行诱导表达。转基因工程菌株YAE5总脂肪酸甲酯C,-C分析表明，三个基因均 得到了表达，并且将底物LA和ALA转化为终产物ARA和EPA，且转化率分 别为9．6％和10．2％。 关键词：多不饱和脂肪酸花生四烯酸A6脱氢途径△8脱氢途径酿酒酵母 II AbstractAbstract Abstract Abstract Polyunsaturated fatty acids(PUFAs)are of great importance for the normal development and metabolism of all organisms，and are indispensible for maintaining human health．Although human beings can synthesize PUFAs from precursors (Linoleic acids and a-Linolenic acid)，sometimes the amount of these essential fatty acids call not meet the needs of human beings．Therefore people should obtain some PUFAs to mmmmn the stability of human bodies．PUFAs are usually derived from marine fishes and marine algae．However,owing to overfishing and contaminating as well as much cost of obtaining oil from marine algae，it is urgent for scientists to find an alternative SOurce of them． Recently,with the rapid development