兔子肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析.doc

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PAGE PAGE 5 兔子肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定兔子血清样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。 实验原理: 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔子肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。用纯化的兔子肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中兔子肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。 试剂盒组成: 试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存 说明书 1份 1份 封板膜 2片(48) 2片(96) 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃ 标准品:360ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃ 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃ 酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃ 浓缩洗涤液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃ 样本处理及要求: 1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。 3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃ 6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融 7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 操作步骤: 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为240ng/L,160ng/L ,80ng/L,40ng/L, 20ng/L)。 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟 配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。 温育:操作同3。 洗涤:操作同5。 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟. 终止

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