酶工程课后作业..pptx

酶工程课后作业;目录：;一 糖化酶; 2 糖化酶的活力测定原理及方法 ⑴ 原理： 目前检测糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物, 通过测定被酶分解产生葡萄糖的含量来定量分析糖化酶的活力。但针对一些特殊情况还有另外一些方法, 如复合糖化酶中作为底物的淀粉同样能被其他类型酶制剂所分解, 要是用麦芽糖作底物, 相比淀粉底物方法而言, 麦芽糖只能被糖化酶专一分解。还有在筛选高活力糖化酶菌株时, 采用Starch- PAGE 电泳活性染色法, 就可既简便、准确、灵敏, 又可节约大量试剂。 糖化酶有催化淀粉水解的作用, 能从淀粉分子非还原性末端开始, 分解α- l, 4 葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘, 再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算出酶活力。 糖化酶水解麦芽糖生成D- 葡萄糖。生成的葡萄糖可通过与葡萄糖脱氢酶反应而测得, 葡萄糖脱氢酶(GlucDH)试剂中加入变构酶可将α- D- 葡萄糖转化成β- D- 葡萄糖。在GlucDH 的作用下, β- D- 葡萄糖与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成NADH,后者即等于葡萄糖初始浓度, 可用于分光光度法在340 nm 测定其数值。 ;⑵ 方法： 根据糖化酶能水解淀粉的性质, 采用Starch, 在分离胶中加入淀粉作为糖化酶的作用底物,电泳结束后, 在醋酸钠缓冲液中浸泡适当时间, 使糖化酶所在部位胶板中的淀粉被酶解, 其余部分的淀粉依然存在, 碘液染色后, 糖化酶存在的部位是无色透明的, 没有被水解的部位被染成蓝色。经实验证明胶板中的淀粉浓度6 %, 醋酸钠的浸泡时间3 h～4 h, 碘染时间1 min 为宜。采用Starch- PAGE 电泳活性染色筛选高活力糖化酶菌株, 活性染色区带的透明程度与酶液的活力呈正相关性, 区带越透明, 表明酶活力越高。 ———— 摘自中国知网《糖化酶的研究概况》张秀媛 ;二 果胶酶;2 果胶酶的活力测定原理及方法 ⑴原理： 测定酶活力的方法主要有还原法、色原底物法、粘度法等, 其中还原法中的3,5 一二硝基水杨酸比色法( 简称DNS 法) 具有操作简便, 对试剂、仪器等条件要求不高等优点。该方法是利用果胶酶在一定温度、时间和条件下水解果胶, 释放出还原性D- 半乳糖醛酸, 与3,5 一二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 即发生显色反应。在一定范围内, 水解生成D- 半乳糖醛酸的量与吸光度成正比[1~2], 与果胶酶活力成正比, 通过分光光度计测定吸光度, 可以计算出果胶酶的活力。该方法( 又称分光光度计法) 简单易行。 ;⑵方法： ①试剂配制 1 乙酸一乙酸钠缓冲溶液( pH4.8) 首先制备0.2mol /L 的乙酸溶液和0.2mol /L 的乙酸钠溶液, 然后将0.2mol /L 乙酸溶液410.0mL 与0.2mol /L 乙酸钠溶液590.0mL 混合均匀, 用酸度计测定。 2 DNS 试剂( 3g/L) 称取3.00g 3,5 一二硝基水杨酸, 溶解于500mL 蒸馏水中, 再逐步加入10.4gNaOH、91.0g C4H4KNaO6·4H2O、2.5g 苯酚和2.5g 无水亚硫酸钠, 温水浴( 不超过48℃) 中不断搅拌, 直至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至1000mL, 保存在棕色瓶中。 3 果胶底物( 5g/L) 称取0.5g 果胶, 用pH4.8的缓冲液溶解, 充分搅拌后, 用缓冲液定容至100mL, 置于冰箱内冷藏( 2~5℃) 。1.2.1.4 D- 半乳糖( 1mg/mL) 精确称量1.000gD- 半乳糖醛酸, 用缓冲溶液定容至1000mL, 获得1mg/mL 的D- 半乳糖醛酸溶液。;②波长选择和标准曲线的制作 取9 支25mL 的刻度试管编号, 并按表1 所示加入各种试剂, 在沸水浴中加热5min, 冷却后定容至25mL。1 号试管为标准空白样, 任选其它一支试管( 本实验选择6 号试管) , 在450～550nm 的范围内每隔10nm 测定溶液的吸光度。再以蒸馏水为空白样, 在450～550nm 的范围内每隔10nm 测定1 号试管溶液的吸光度。根据选择的最适波长, 在此波长下以1 号试管为标准空白样测定其它试管内溶液的吸光度, 利用回归分析求得标准曲线方程和相关系数。 ;③DNS 试剂用量的选择 如表3其它试剂用量不变, 将DNS 试剂用量设为3 种处理, 即1.5、2.5、5.0mL, 然后在最适波长下测定吸光度值, 通过回归分析求得标准曲线方程和相关系数。根据相关系数确定DNS 试剂的最适