肝纤维化大鼠肝组织及血液微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的影响药理学专业论文.docxVIP

解放军医学院硕士学位论文作 解放军医学院硕士学位论文 作 者：闰成 学科专业：药理学 导 师：侯艳宁 肝纤维化大鼠肝组织及血液微环境对人脐带间充质干细胞向 肝细胞分化的影响 中文摘要 目的： 本课题组的前期研究证明肝功正常的大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间 充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，HUCMSCs)定向分化 为具有部分肝细胞功能的肝样细胞，考虑到干细胞在移植后可随血液循环“归巢” 于损伤靶器官的特点，我们推测纤维化肝组织微环境也许更有利于干细胞向肝细 胞的定向分化。本研究拟采用大鼠纤维化肝组织匀浆上清液体外模拟纤维化肝组 织微环境对HUCMSCs进行诱导培养，从细胞形态、肝细胞表面标志物、肝细胞 功能等方面评价其在特定微环境下的分化潜能，并进一步平行比较纤维化肝组织 微环境与正常肝组织微环境及肝纤维化大鼠血液微环境与正常大鼠血液微环境诱 导HUCMSCs向肝细胞分化的效果，旨在为干细胞移植治疗肝纤维化提供理论依 据和实验基础。 方法： 1．大鼠纤维化肝组织微环境诱导人脐带问充质干细胞向肝细胞分化的实验研究 采用腹腔注射3％硫代乙酰胺生理盐水溶液(200mg／kg，2次／周，共4周)的方 法制备SD(Sprague Dawley)大鼠肝纤维化模型．取造模成功的大鼠肝脏制备肝组织 匀浆上清液。取第三代HUCMSCs进行分组培养：①对照组：含10％／I台牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的DMEM／F12培养基：②纤维化肝组织匀浆组：含10％FBS 及509／L纤维化肝组织匀浆上清液的DMEM／F12培养基。诱导开始后于倒置显微 镜下观察并记录细胞形态学变化：取对照组及诱导7d的纤维化肝组织匀浆组细胞， 1 万方数据 解放军医学院硕士学位论文采用Western 解放军医学院硕士学位论文 采用Western Blot法检测细胞角蛋白18(Cytokeratin 18，CKl8)、甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein，AFP)、CYP3A4的表达情况，采用过碘酸雪夫(Periodic Acid·Schiff, PAS)染色检测细胞储存糖原的能力，分别采用二乙酰肟比色法及酶联免疫吸附实 露9(Enzyme—linked Immunosorbent Assay，EUSA)法测定两组细胞培养液中尿素 (Blood Urea Nitrogen，BⅦ叼及白蛋白(Albumin，ALB)的含量。 2．纤维化肝组织微环境与正常肝组织徼环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分 化效果的比较研究 将第三代HUCMSCs进行分组培养：①对照组：含10％FBS的DMEM／F12培 养基：②纤维化肝组织匀浆组：含10％FBS及509／L纤维化肝组织匀浆上清液的 DMEM／F12培养基。③正常肝组织匀浆组：含10％FBS及1009／L正常肝组织匀浆 上清液的DMEM／F12培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变 化：取对照组及诱导7d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CKl8、AFP、CYP3A4、 CYP2E1、CYP2D6、色氨酸2，3-双加氧酶(Tryptophan2，3-Dioxygenase，TPH2)的 表达情况，采用ELISA法测定各组细胞培养液中ALB的含量。 3．肝纤维化大鼠血液微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究 分离肝纤维化大鼠和正常大鼠血清。取第三代HUCMSCs进行分组培养：肝 纤维化大鼠血清组：含5ml／L肝纤维化大鼠血清的DMEM／F12(含10％FBS)J唔养基： 正常大鼠血清组：含5ml／L正常大鼠血清的DMEM／F12(含10％FBS)培养基。对照 组：DMEM／F12(含10％FBS)培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察并记录各组 细胞形态学变化：取诱导7d时的各组细胞，采用细胞免疫荧光检测AFP、CKl8 的表达，采用Western Blot法检测ALB、TPH2、CYP3A4的表达，采用二乙酰肟 比色法测定各组细胞培养液中BUN的含量。 结果： 1．本研究第一部分，与对照组长梭形细胞相比，纤维化肝组织匀浆组细胞于诱导 l d时即可见到细胞两极回缩，胞体变短；诱导7 d时，细胞呈不规则形或类圆形， 胞体丰满。Western Blot检测示，对照组细胞未见AFP、CKl8、CYP3A4表达；匀 浆组细胞可表达肝细胞表面标志物AFP、CKl8及与代谢功能相关的重要蛋白 CYP3A4。对照组上清液中BUN、ALB浓度分别为(0．434-0．07)mmol／L和 (8．08士0．41)lxg／mL，匀浆组分别为(2。524-0．20)mmol／L和(41．484-4．1