葛根素对支气管上皮细胞炎性作用的机制研究临床检验诊断学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文中文摘要 温州医学院硕士学位论文 中文摘要 葛根素对支气管上皮细胞炎性作用的机制研究 目的1．构建支气管上皮细胞(BEAS-2B cells)币1]中性粒细胞(Neutrophils； NEU)混合培养体系。2．在混合培养体系中加入不同浓度的葛根素(Puerarin； PUE)进行药物干预，探讨葛根素对混合培养体系黏附分子表达的影响。3．构 建支气管上皮细胞(BEAS．2B cells)和嗜酸性粒细胞(Eosinophils；EOS)混合 ；培养体系。4．在混合培养体系中加入不同浓度的葛根素(Puerarin；PUE)进行 药物干预，探讨葛根素对混合培养体系炎性细胞因子分泌的影响。结合以上两部 分内容，进一步阐释葛根素对支气管哮喘等气道炎症反应性疾病抑制作用的机制。 方法1．采用免疫磁珠阳选法分离纯化人外周血中性粒细胞，与支气管上皮 细胞混合培养，构建实验体系。2．实验随机分成6组：即①单独培养的支气管 上皮细胞(BEAS．2B组)；②单独培养的中性粒细胞组(Neutrophils组)；③支 气管上皮细胞和中性粒细胞混合培养组(BEAS．2B+Neutrophils组)；④加501xg／ml 葛根素的支气管上皮细胞和中性粒细胞混合培养组(BEAS．2B扑咂U+PUE50组)； ⑤加1001xg／ml葛根素的支气管上皮细胞和中性粒细胞混合培养组 (BEAS．2B删HPUEl00组)；⑥加200llg／ml葛根素的支气管上皮细胞和中性 粒细胞混合培养组(BEAS．2B+NEU+PUE200组)。实验使用两种细胞共同培养， 而在应用流式细胞仪以及Real．time PCR分析时，都需要将③．⑥混合培养组中的 两种细胞分离开来(即在结果中用BO，B50，B100，B200，NO，N50，N100， N200来表示各组)，分别与各自单独培养的细胞(即用B组和N组来表示)做 比较。3．应用流式细胞术(FCM)检测BEAS．2B细胞和NEU细胞表面黏附分 子(ICAM．1、ICAM．3和VCAM．1)的蛋白质合成。应用Real．time PCR法检测 上述细胞中ICAM．1、ICAM．3和VCAM-I的基因表达。4．采用免疫磁珠阴选法 分离纯化人外周血嗜酸性粒细胞，与支气管上皮细胞混合培养，构建实验体系。 5．实验随机分成6组：即①单独培养的支气管上皮细胞(BEAS．2B组)：②单独 培养的嗜酸性粒细胞组(Eosinophils组)；③支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞混 合培养组(BEAS．2B+Eosinophils组)；④加50}tg／ml葛根素的支气管上皮细胞和 嗜酸性粒细胞混合培养组(BEAS．2B+EOS+PUE50组)；⑤加1 001．tg／ml葛根素的 支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞混合培养组(BEAS．2B+EOS+PUE 1 00组)：⑥ 温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 加200pg／ml葛根素的支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞混合培养组 (BEAS-2B+EOS坩．UE200组)。6．应用ELISA方法定量测定BEAS．2B细胞和 Eosinophils细胞单独培养、混合培养、加葛根素干预培养体系18h后，细胞上清 液中炎性细胞因子的分泌情况。 结果1．用免疫磁珠阳选法和阴选法可以分离得到纯度98％、活力98％的 中性粒细胞和纯度95％、活力97％的嗜酸性粒细胞。2．BEAS．2B细胞和NEU 细胞混合培养组中BEAS-2B表面的ICAM-I平均荧光强度(MFI)显著高于 BEAs-2B单独培养组(P0．001)，混合培养组中BEAS．2B表面的ICAM．3平均 荧光强度(MFI)显著高于BEAS．2B单独培养组(P0．05)，混合培养组中 BEAS．2B表面的VCAM-1平均荧光强度(MFl)显著高于BEAS．2B单独培养组 (户lo．001)。混合培养组中NEU表面的ICAM-I MFI显著高于NEU单独培养组 (闷．001)，混合培养组中NEU表面的VCAM-l MFI也显著高于NEU单独培 养组(p—o．001)。与BEAS．2B细胞单独培养相比，混合培养组中BEAS．2B细胞 ICAM．1基因表达水平明显上调(P0．001)，IC√W．3基因表达水平明显上调 (p0．01)，VCAM．1基因表达水平也显著上调(P．0．01)。与NEU细胞单独培 养相比，混合培养组中NEU细胞ICAM．1基因表达水平明显上调(p0．001)， VCAM．I基因表达水平也明显上调(po．05)。不同浓度葛根素作用后抑制了混 合培养组BEAS．2B细胞中ICAM．1、ICAM-3、VCAM．1和NEU细胞中ICAM．1、 VCAM．I基因表达，混合培养组BEAS-2B细胞表面ICAM．1蛋