全基因DNA抽提方法(SNET).docx

抽提鼠尾DNA(全基因组) 1.简介 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。 ? 2.材料与方法 2.1.仪器设备： 聚丙烯管（17*100mm）、预设为55℃的振荡恒温箱、台式离心机。 ? 2.2.材料： 低温保存的鼠尾 ? 2.3.药品： (1)SNET裂解缓冲液：20mmol/L tris-Cl (pH8.0);5mmol/L EDTA(pH 8.0);400mmol/L NaCl;1%(m/v) SDS (2)蛋白酶K：临时用时再加，保存时20mg/ml (3)乙醇 (4)异丙醇 (5)酚：氯仿：异丙醇=25：24：1? （v/v/v）。酚和氯仿要避光保存 (6)TE(PH 8.0)：(10*Tris EDTA) ?2.4.方法： (1)溶解鼠尾： 在SNET中加入蛋白酶K，使其终浓度为400ug/ml。将1cm鼠尾放入其中。55℃垂直振荡，消化过夜。 (2)除杂质： 消化过夜的鼠尾溶液为乳白色。剧烈振荡，最大转速离心10min，取上层清液。 (3)粗提取： 向上述液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，密闭管口，颠倒混匀数次。 将溶液置于17*100mm的Falcon聚内烯管中，室温下转速为12000r/min离心10min，分离有机相和水相；吸取上层水相至一新的离心管中。 (4)沉淀DNA： 加入等体积的异丙醇，转速为12000r/min离心10min，收集沉淀的DNA。 (5)除异丙醇： 小心去除异丙醇，加入1ml 70%的乙醇，如果沉淀较松散，再离心5min，除去70%的乙醇，室温下空气中干燥沉淀约15~20min。 (6)溶解DNA： 加入0.5mlTE（PH 8.0），4℃下轻柔振荡。 (7)电泳检测： ? 3.各种材料药品作用： (1)酚：氯仿：异丙醇=25：24：1? （v/v/v）的作用： 酚——Tris饱和酚：用于变性蛋白质； 氯仿：用于变性蛋白质，分层； 异丙醇：消除泡沫。 ?(2)SNET裂解缓冲液： 20mmol/L tris-Cl (pH8.0)：用于平衡pH值； 5mmol/L EDTA(pH 8.0)：螯合剂，降解DNA酶； 400mmol/L NaCl：保持盐浓度； 1%(m/v) SDS：破膜，DNA与组蛋白分离.