第五章-4 高等植物基因工程-10.8.pptVIP

（一）高等植物的遗传学特征 （二）高等植物基因工程的基本概念 （三）高等植物的基因转移系统 ：合成植物生长素、细胞分裂素； 农杆菌介导法、基因枪法回顾 新霉素抗性基因（neor） 庆大霉素抗性基因（gentr） 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar） ?-葡萄糖苷酸酶基因（gus） 胭脂碱和章鱼碱 氯霉素乙酰转移酶基因（cat ） 荧光素酶基因（luc） 绿色荧光蛋白基因（gfp） （四）高等植物的基因表达系统 高等植物的基因表达系统 RNA操作困难，不适合作为克隆载体。 花椰菜花叶病毒(CaMV)：双链DNA病毒 双生病毒(Geminivirus)：单链DNA病毒 两种常用的植物病毒载体： 转染植物细胞原生质体 利用植物病毒载体转化植物细胞的战略： 转染植物组织 以双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)基因组为载体，去除有关的致病基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。 1）转染植物细胞原生质体 1）即使切除基因组中的非必需序列，其承载外源基因的能力还是有限，只能插入很小的片段。 花椰菜花叶病毒载体： 2）宿主范围非常窄，主要是芸苔属植物，如芜菁、甘蓝、花椰菜等。 2）转染植物组织 A链能单独在植物细胞中复制，含一部分病毒包衣蛋白基因；B链含另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。 植物双生病毒(Geminiviruses)为单链DNA病毒，成熟病毒呈双颗粒状，每个颗粒中含一条不同的DNA单链。 转染植物组织 双生病毒家族成员--番茄金色花叶病毒(TGMV)表达载体的构建程序 2）可引起破坏性侵染，需严格防护，防止载体从宿主中逃逸，侵染自然中的植物。 双生病毒载体： 1）宿主范围广，是一种很有潜力的植物病毒载体，可侵染重要的作物（如玉米、小麦）。 3、植物细胞的直接转化程序 基因枪转化法 电穿孔转化法 激光微束穿孔法 多聚物介导法 花粉管通道法 基因枪转化法 快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，被转化的细胞或组织容易再生成植株；但成本高，转化率低。 所有涉及植物原生质体的转化方法（农杆菌介导法、植物病毒转化法、电穿孔法、多聚物介导法）均存在一个难题：原生质体很难再生出整株植物。 4、植物原生质体的再生 原生质体的再生效率在植物转基因技术中至关重要。 植物原生质体的再生程序 1）将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含纤维素酶的缓冲液中保温，悬浮物离心去除细胞碎片。 2）将原生体悬浮液滴在无菌滤纸片上，置于含普通植物细胞（滋养细胞）的固体再生培养基表面。 原生质体不直接接触滋养细胞，但可吸收其分泌扩散的植物生长因子及其它化合物。 3）培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含高浓度分裂素、低浓度生长素的固体培养基上，继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽。 4）将嫩芽置于含低浓度生长素、无分裂素的固体培养基上，使其根部发育。 5）3周后，将之移植于土壤中，长成整株植物。 1）植物基因工程中的选择标记： 5、植物基因工程中的选择标记和报告基因 2）植物基因工程中的报告基因： 花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子能在许多植物物种、几乎所有发育阶段、所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。 启动子是决定基因表达部位、时间、强度的主要调控元件。 在高等植物基因工程中，外源基因的时空特异性表达尤为重要，因为很多外源基因的表达产物对植物早期的生长、发育有影响，甚至会致死植株。 外源基因的四环素诱导系统 外源基因的乙醇诱导系统 外源基因的地塞米松诱导系统 外源基因的类固醇诱导系统 1、外源基因的四环素诱导系统 Tc-on型四环素诱导系统 CaMV 35S P Plant nos T GUS tet操作子 显色反应 四环素 CaMV 35S P Plant nos T ?-葡萄糖苷酸酶基因GUS tet操作子 四环素诱导型报告基因表达盒 CaMV 35S P Plant nos T E.coli tetR 四环素阻遏蛋白基因表达盒 TetR Tc-off型四环素阻遏系统 35S P Plant nos T GFP tet 四环素 tTA融合蛋白 DNA结合活性 转录激活作用 tTA激活因子表达盒 CaMV 35S P Plant nos T tetR VP16 35S P Plant